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    • 专利摘要:
    本発明は、ポロ様キナーゼ1（PLK-1）発現を標的とする干渉RNA（例えば、siRNA、aiRNA、miRNA）を含む組成物、およびPLK-1発現をサイレンシングするためのそのような組成物を使用する方法を提供する。より具体的には、本発明は、PLK-1発現をサイレンシングする未修飾の干渉RNA分子および化学的に修飾された干渉RNA分子、ならびにそれらの使用法を提供する。本発明は、本明細書に記載された干渉RNA分子、カチオン性脂質、および非カチオン性脂質を含み、粒子の凝集を阻害する複合脂質をさらに含んでいていもよい、血清安定核酸-脂質粒子（例えば、SNALP）も提供する。本発明は、本明細書に記載された干渉RNA分子を哺乳動物対象へ投与することにより、PLK-1遺伝子発現をサイレンシングする方法をさらに提供する。本発明は、免疫刺激特性を有するPLK-1干渉RNAを同定し、かつ／または修飾する方法をさらに提供する。逐次、PLK-1干渉RNAを送達した後、化学療法薬を送達することを含む、化学療法薬の効果に対して癌細胞のような細胞を感作する方法も、提供する。
    公开号:JP2011507534A
    申请号:JP2010539978
    申请日:2008-12-23
    公开日:2011-03-10
    发明作者:アダム ジャッジ；イアン マクラクラン
    申请人:プロチバ バイオセラピューティクス インコーポレイティッド；
    IPC主号:C12N15-113
    专利说明:

    [0001] 関連出願の相互参照
    本願は、2007年12月27日出願の米国仮出願第61/017,075号、2008年4月15日出願の米国仮出願第61/045,228号、および2008年9月26日出願の米国仮出願第61/100,653号（これらの開示は、全ての目的のため参照により本明細書に完全に組み入れられる）に基づく優先権を主張する。]
    背景技術

    [0002] 発明の背景
    細胞増殖およびプログラム細胞死は、生物の成長および発達において重要な役割を果たしている。癌のような増殖性疾患においては、細胞増殖および／またはプログラム細胞死の過程が、しばしば、攪乱される。例えば、癌細胞は、おそらく変異のため、細胞周期の正の調節因子の過剰発現または細胞周期の負の調節因子の減少のいずれかを通して、無調節の細胞分裂を有していることがある。または、癌細胞は、アポトーシスの負の調節因子の過剰発現を通して、プログラム細胞死を受ける能力を失っていることもある。従って、癌細胞のチェックポイントコントロールおよびプログラム細胞死の過程を回復するであろう、新しい治療剤を開発する必要が存在している。]
    [0003] RNA干渉（RNAi）は、二本鎖RNA（dsRNA）の認識が、最終的に、遺伝子発現の転写後抑制をもたらす、進化的に保存された過程である。この抑制は、相補塩基対合を通してmRNAの特異的な分解を誘導する、低分子干渉RNA（siRNA）と呼ばれる短いdsRNAによって媒介される。いくつかのモデル系において、この天然の応答は、遺伝子機能の調査のための強力なツールへと開発されている（例えば、Elbashir et al.,Genes Dev.,15:188-200(2001)；Hammond et al.,Nat.Rev.Genet.,2:110-119(2001)参照）。より最近、合成21ヌクレオチドdsRNA二重鎖の哺乳動物細胞への導入が、遺伝子発現を効率的にサイレンシングし得ることが発見された。正確な機序はまだ不明であるが、RNAiは、関心対象の遺伝子を不活化するための新しい方式を提示する。特に、癌のような新生物障害の処置のため、RNAiは、ある種の遺伝子、例えば、抗アポトーシス分子、増殖因子、増殖因子受容体、有糸分裂紡錘体タンパク質、細胞周期タンパク質、血管形成因子、癌遺伝子、細胞内シグナル伝達因子、分子シャペロン、およびそれらの組み合わせの発現をモジュレートする（例えば、低下させる）ための可能性のある新しいアプローチを提供する。]
    [0004] 一つのそのような標的は、ポロ様キナーゼとして公知のセリン／トレオニンプロテインキナーゼのファミリーのメンバーをコードするポロ様キナーゼ1（PLK-1）遺伝子である（例えば、Nigg,Curr.Opin.Cell.Biol.,10:776-783(1998)参照）。真核生物において、細胞周期進行の調節は、サイクルを通じて発現が変動する遺伝子群によって制御される。サイクリン依存性キナーゼおよびそれらの関連調節サブユニット、サイクリンは、細胞周期の第一の調節因子である。これらのヘテロダイマー複合体は、下流の標的をリン酸化することにより作用し、次に、その標的が、細胞周期の後続の期に移行するために必要な核タンパク質を解放するシグナリング事象を誘発する。PLK-1のようなポロ様キナーゼは、これらのヘテロダイマー複合体の活性化および不活化に寄与する。]
    [0005] 細胞が細胞周期を進行する際、ポロ様キナーゼは、細胞周期の複数の段階を制御するために、量、活性、および局在の変動を受ける（Hamanaka et al.,J.Biol.Chem.,270:21086-21091(1995)）。このキナーゼのファミリーは、中心体成熟（Lane et al.,J.Cell.Biol.,135:1701-1713(1996)）、双極紡錘体形成（Golsteyn et al.,J.Cell.Biol.,129:1617-1628(1995)）、DNA傷害チェックポイント順応（Arnaud et al.,Chromosoma,107:424-429(1998)）、および後期促進複合体の調節（Kotani et al.,Mol.Cell,1:371-380(1998)）においても機能する。]
    [0006] PLK-1は、有糸分裂通過のために必要とされる、キイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）遺伝子ポロ（polo）の哺乳動物カウンターパートとして同定されたこのキナーゼファミリーの最初のメンバーであった（Golsteyn et al.,J.Cell.Sci.,107:1509-1517(1994)；Hamanaka et al.,Cell.Growth Differ.,5:249-257(1994)；Holtrich et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,91:1736-1740(1994)；Lake et al.,Mol.Cell.Biol.,13:7793-7801(1993)）。PLK-1の発現は、細胞の有系分裂活性と相関しており（Golsteyn et al.,J.Cell.Sci.,107:1509-1517(1994)；Lake et al.,Mol.Cell.Biol.,13:7793-7801(1993)）、肺、結腸、胃、平滑筋、および食道を含むいくつかの起源の腫瘍において高いことが示された（Holtrich et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,91:1736-1740(1994)）。PLK-1の過剰発現または構成性発現が、哺乳動物細胞の悪性形質転換を誘導することも示されている（Mundt et al.,Biochem.Biophys.Res.Commun.,239:377-385(1997)；Smith et al.,Biochem.Biophys.Res.Commun.,234:397-405(1997)）。成長中のマウスNIH3T3繊維芽細胞へのPLK-1アンチセンスRNAの微量注入は、トリチウム標識されたチミジンの取り込みを阻止することが示され、このことから、PLK-1発現が、増殖中の細胞に制限されており、増殖中の細胞によって必要とされていることが示唆された（Hamanaka et al.,Cell.Growth Differ.,5:249-257(1994)）。]
    [0007] この結論のさらなる支持は、PLK-1発現のレベルの上昇が、非小細胞肺癌（Wolf et al.,Oncogene,14:543-549(1997)）、乳癌および肺癌（Yuan et al.,Am.J.Pathol.,150:1165-1172(1997)）、食道癌（Tokumitsu et al.,Int.J.Oncol.,15:687-692(1999)）、ならびに頭頸部の扁平上皮癌（Knecht et al.,Cancer Res.,59:2794-2797(1999)）の有意な予後指標であることを示す研究に見出される。従って、PLK-1の活性、発現、または機能の薬理学的モジュレーションは、病理学的状態における治療的介入の適切な点であり得る。]
    [0008] 現在、PLK-1の合成を効率的に阻害する公知の治療剤は存在せず、PLK-1機能をモジュレートすることを目標とした調査戦略は、抗体およびアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用を含んできた。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドを使用したPLK-1発現の阻害は、培養A549細胞における細胞生存性の減少およびヌードマウスA549異種移植片における抗腫瘍活性をもたらした（Elez et al.,Biochem.Biophys.Res.Commun.,209:352-356(2000)）。同様に、米国特許第6,906,186号は、インビトロ細胞培養系におけるアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用したPLK-1発現の阻害を記載している。しかしながら、これらの戦略は、治療プロトコルとしては試験されておらず、従って、インビボでPLK-1機能を効率的に阻害することができる薬剤の長年の必要性は依然として残っている。]
    [0009] このように、PLK-1発現を特異的にモジュレートするための組成物および方法が必要とされている。本発明は、これらおよびその他の必要性を解決する。]
    [0010] 本発明は、ポロ様キナーゼ1（PLK-1）発現を標的とする干渉RNA（例えば、siRNA、aiRNA、miRNA）を含む組成物、およびPLK-1発現をサイレンシングするためのそのような組成物の使用法を提供する。より具体的には、本発明は、PLK-1発現をサイレンシングする未修飾の干渉RNA分子および化学的に修飾された干渉RNA分子、ならびに、例えば、肝細胞癌（HCC）のような癌を処置するための、それらの使用法を提供する。本発明は、本明細書に記載された干渉RNA分子、カチオン性脂質、および非カチオン性脂質を含み、粒子の凝集を阻害する複合脂質をさらに含んでいてもよい、血清安定核酸-脂質粒子（例えば、SNALP）も提供する。本発明は、本明細書に記載された干渉RNA分子を哺乳動物対象へ投与することにより、PLK-1遺伝子発現をサイレンシングする方法をさらに提供する。本発明は、免疫刺激特性を有するPLK-1干渉RNAを同定し、かつ／または修飾する方法をさらに提供する。逐次、PLK-1干渉RNAを送達した後、化学療法薬を送達することを含む、化学療法薬の効果に対して癌細胞のような細胞を感作する方法も、提供される。]
    [0011] 一つの局面において、本発明は、PLK-1発現をサイレンシングすることができる、約15〜約60ヌクレオチド長（例えば、15〜60、15〜50、15〜40、15〜30、15〜25、もしくは19〜25ヌクレオチド長、または15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、もしくは25ヌクレオチド長）の二本鎖領域を含む、修飾siRNA分子を提供する。]
    [0012] 典型的には、修飾siRNA分子は、二本鎖領域内に1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、またはそれ以上の修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、修飾siRNAは、二本鎖領域内に約1％〜約100％（例えば、約1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、または100％）の修飾ヌクレオチドを含む。好ましい態様において、二本鎖領域内のヌクレオチドの約25％未満（例えば、約25％、20％、15％、10％、もしくは5％未満）、または約1％〜約25％（例えば、約1％〜25％、5％〜25％、10％〜25％、15％〜25％、20％〜25％、もしくは10％〜20％）が、修飾ヌクレオチドを含む。]
    [0013] いくつかの態様において、修飾siRNAは、2'-O-メチル（2'OMe）ヌクレオチド、2'-デオキシ-2'-フルオロ（2'F）ヌクレオチド、2'-デオキシヌクレオチド、2'-O-(2-メトキシエチル)（MOE）ヌクレオチド、ロックド核酸（LNA）ヌクレオチド、およびそれらの混合物を含むが、これらに限定はされない、修飾ヌクレオチドを含む。好ましい態様において、修飾siRNAは、例えば、2'OMe-グアノシンヌクレオチド、2'OMe-ウリジンヌクレオチド、2'OMe-アデノシンヌクレオチド、2'OMe-シトシンヌクレオチド、およびそれらの混合物のような2'OMeヌクレオチド（例えば、2'OMeプリンヌクレオチドおよび／または2'OMeピリミジンヌクレオチド）を含む。ある種の例において、修飾siRNAは、2'OMe-シトシンヌクレオチドを含まない。他の態様において、修飾siRNAはヘアピンループ構造を含む。]
    [0014] 修飾siRNAは、siRNA分子の二本鎖領域の一方の鎖（即ち、センスもしくはアンチセンス）または両方の鎖に、修飾ヌクレオチドを含み得る。好ましくは、siRNA二重鎖の二本鎖領域内の選択された位置においてウリジンヌクレオチドおよび／またはグアノシンヌクレオチドが修飾される。ウリジンヌクレオチド修飾に関しては、センス鎖および／またはアンチセンス鎖のウリジンヌクレオチドのうちの少なくとも1個、2個、3個、4個、5個、6個、またはそれ以上が、2'OMe-ウリジンヌクレオチドのような修飾ウリジンヌクレオチドであり得る。いくつかの態様において、センス鎖および／またはアンチセンス鎖の全てのウリジンヌクレオチドが、2'OMe-ウリジンヌクレオチドである。グアノシンヌクレオチド修飾に関しては、センス鎖および／またはアンチセンス鎖のグアノシンヌクレオチドのうちの少なくとも1個、2個、3個、4個、5個、6個、またはそれ以上が、2'OMe-グアノシンヌクレオチドのような修飾グアノシンヌクレオチドであり得る。いくつかの態様において、センス鎖および／またはアンチセンス鎖の全てのグアノシンヌクレオチドが、2'OMe-グアノシンヌクレオチドである。]
    [0015] いくつかの態様において、修飾siRNA分子は、対応する未修飾siRNA配列より低免疫刺激性である。ある種の態様において、修飾siRNAは、対応する未修飾siRNA配列より、少なくとも約5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％、低免疫刺激性である。他の態様において、修飾siRNAは、対応する未修飾siRNA配列より、少なくとも約70％（例えば、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％）、低免疫刺激性である。修飾siRNA分子および対応する未修飾siRNA分子の免疫刺激特性は、例えば、（SNALP送達系または本明細書に開示されたその他のリポプレックス系のような）適切な脂質に基づく送達系を使用した哺乳動物への全身投与または哺乳動物応答細胞のトランスフェクションの約2〜約12時間後に、INF-αおよび／またはIL-6を測定することにより、決定され得ることが、当業者には容易に明らかであろう。]
    [0016] ある種の態様において、修飾siRNA分子は、対応する未修飾siRNAのものの10倍以下のIC50（即ち、最大半量阻害濃度）を有する（即ち、修飾siRNAは、対応する未修飾siRNAのIC50の10倍以下であるIC50を有する）。他の態様において、修飾siRNAは、対応する未修飾siRNA配列のものの3倍以下のIC50を有する。さらに他の態様において、修飾siRNAは、対応する未修飾siRNAのものの2倍以下のIC50を有する。当業者に公知の方法を使用して、用量応答曲線を作成し、修飾siRNAおよび対応する未修飾siRNAに関するIC50値を容易に決定することができることが、当業者には容易に明らかであろう。]
    [0017] さらにもう一つの態様において、修飾siRNAは、対応する未修飾siRNA配列と比べて、標的配列の発現の少なくとも5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、または100％をサイレンシングすることができる。]
    [0018] いくつかの態様において、修飾siRNAは、例えば、二本鎖領域のセンス鎖および／またはアンチセンス鎖に、リン酸骨格修飾を含まない。他の態様において、修飾siRNAは、例えば、二本鎖領域のセンス鎖および／またはアンチセンス鎖に、2'-デオキシヌクレオチドを含まない。ある種の例において、センス鎖および／またはアンチセンス鎖の二本鎖領域の3'末のヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドではない。ある種の他の例において、センス鎖および／またはアンチセンス鎖の二本鎖領域の3'末に近いヌクレオチド（例えば、3'末の1、2、3、または4ヌクレオチド以内）は、修飾ヌクレオチドではない。]
    [0019] 本発明の修飾siRNA分子は、二本鎖領域の片側もしくは両側に1ヌクレオチド、2ヌクレオチド、3ヌクレオチド、4ヌクレオチド、もしくはそれ以上のヌクレオチドの3'突出を有していてもよいし、または二本鎖領域の片側もしくは両側に突出を欠いていてもよい（即ち、平滑末端を有していてもよい）。好ましくは、修飾siRNAは、二本鎖領域の片側に2ヌクレオチドの3'突出を有する。ある種の例において、アンチセンス鎖の3'突出は、標的配列に対する相補性を有し、センス鎖の3'突出は、標的配列の相補鎖に対する相補性を有する。または、3'突出は、標的配列またはその相補鎖に対する相補性を有していない。いくつかの態様において、3'突出は、2'-デオキシ（2'H）ヌクレオチドのようなヌクレオチドを1個、2個、3個、4個、またはそれ以上含む。ある種の好ましい態様において、3'突出は、デオキシチミジン（dT）ヌクレオチドおよび／またはウリジンヌクレオチドを含む。他の態様において、二本鎖領域の片側または両側の3'突出のヌクレオチドのうちの1個または複数個が、修飾ヌクレオチドを含む。修飾ヌクレオチドの非限定的な例は、上記の通りであり、2'OMeヌクレオチド、2'-デオキシ-2'Fヌクレオチド、2'-デオキシヌクレオチド、2'-O-2-MOEヌクレオチド、LNAヌクレオチド、およびそれらの混合物を含む。好ましい態様において、siRNAのセンス鎖および／またはアンチセンス鎖に存在する3'突出の1個、2個、3個、4個、またはそれ以上のヌクレオチドが、2'OMe-グアノシンヌクレオチド、2'OMe-ウリジンヌクレオチド、2'OMe-アデノシンヌクレオチド、2'OMe-シトシンヌクレオチド、およびそれらの混合物のような2'OMeヌクレオチド（例えば、2'OMeプリンヌクレオチドおよび／または2'OMeピリミジンヌクレオチド）を含む。]
    [0020] 本発明のsiRNA分子は、PLK-1発現をサイレンシングする修飾siRNA配列を少なくとも一つ含んでいてもよいし、またはそれらのカクテル（例えば、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、もしくはそれ以上）を含んでいてもよい。ある種の例において、本明細書に記載された修飾siRNAのうちの一つまたは複数が、PLK-1発現をサイレンシングする一つまたは複数（例えば、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、またはそれ以上）の未修飾siRNA配列とのカクテルの中に存在する。いくつかの態様において、修飾siRNA分子は、表1〜7に示された未修飾配列の少なくとも一つまたはそれらのカクテルの化学的に修飾された（例えば、2'OMe修飾された）バージョンを含む。他の態様において、修飾siRNA分子は、表3、6、および10〜11に示された修飾配列の少なくとも一つまたはそれらのカクテルを含む。好ましくは、修飾siRNA分子は、PLK1424 2/6、PLK1424 U4/GU、PLK1424 U4/G、PLK773 G/GU、PLK1425 3/5、およびそれらの混合物からなる群より選択される。]
    [0021] いくつかの態様において、対応する未修飾siRNA配列は、少なくとも1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、またはそれ以上の5'-GU-3'モチーフを含む。5'-GU-3'モチーフは、未修飾siRNA配列のセンス鎖にあってもよいし、アンチセンス鎖にあってもよいし、または両方の鎖にあってもよい。5'-GU-3'モチーフは相互に隣接していてもよいし、または、それらは1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、もしくはそれ以上のヌクレオチドによって分離されていてもよい。]
    [0022] ある種の態様において、修飾siRNAは、例えば、修飾siRNAを哺乳動物の細胞へ送達するための、担体系をさらに含む。本発明において使用するのに適している担体系の例には、核酸-脂質粒子、リポソーム、ミセル、ビロソーム、核酸複合体、およびそれらの混合物が含まれるが、これらに限定はされない。ある種の例において、siRNAは、リポプレックスが形成されるよう、カチオン性脂質のような脂質と複合体化される。ある種の他の例において、修飾siRNAは、ポリプレックスが形成されるよう、カチオン性ポリマー（例えば、ポリエチレンイミン（PEI））のようなポリマーと複合体化される。修飾siRNAは、シクロデキストリンまたはそのポリマーと複合体化されてもよい。好ましくは、修飾siRNAは、核酸-脂質粒子に封入される。]
    [0023] 本発明は、本明細書に記載された修飾siRNA分子と薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物も提供する。]
    [0024] もう一つの局面において、本発明は、PLK-1発現を標的とする核酸-脂質粒子を提供する。核酸-脂質粒子は、PLK-1発現をサイレンシングする修飾siRNA分子、カチオン性脂質、および非カチオン性脂質を含む。ある種の例において、核酸-脂質粒子は、粒子の凝集を阻害する複合脂質をさらに含む。好ましくは、核酸-脂質粒子は、PLK-1発現をサイレンシングする修飾siRNA分子、カチオン性脂質、非カチオン性脂質、および粒子の凝集を阻害する複合脂質を含む。]
    [0025] カチオン性脂質は、例えば、1,2-ジリノレイルオキシ-N,N-ジメチルアミノプロパン（DLinDMA）、1,2-ジリノレニルオキシ-N,N-ジメチルアミノプロパン（DLenDMA）、N,N-ジオレイル-N,N-ジメチルアンモニウムクロリド（DODAC）、ジオクタデシルジメチルアンモニウム（DODMA）、ジステアリルジメチルアンモニウム（DSDMA）、N-(1-(2,3-ジオレイルオキシ)プロピル)-N,N,N-トリメチルアンモニウムクロリド（DOTMA）、N,N-ジステアリル-N,N-ジメチルアンモニウムブロミド（DDAB）、N-(1-(2,3-ジオレイルオキシ)プロピル)-N,N,N-トリメチルアンモニウムクロリド（DOTAP）、3-(N-(N',N'-ジメチルアミノエタン)-カルバモイル)コレステロール（DC-Chol）、N-(1,2-ジミリスチルオキシプロパ-3-イル)-N,N-ジメチル-N-ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（DMRIE）、2,3-ジオレイルオキシ-N-[2(スペルミン-カルボキサミド)エチル]-N,N-ジメチル-1-プロパンアミニウムトリフルオロアセテート（DOSPA）、ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン(DOGS）、3-ジメチルアミノ-2-(コレスタ-5-エン-3-ベータ-オキシブタン-4-オキシ)-1-(cis,cis-9,12-オクタデカジエンオキシ)プロパン（CLinDMA）、2-[5'-(コレスタ-5-エン-3-ベータ-オキシ)-3'-オキサペントキシ)-3-ジメチル-1-(cis,cis-9',1-2'-オクタデカジエンオキシ)プロパン（CpLinDMA）、N,N-ジメチル-3,4-ジオレイルオキシベンジルアミン（DMOBA）、1,2-N,N'-ジオレイルカルバミル-3-ジメチルアミノプロパン（DOcarbDAP）、2,3-ジリノレオイルオキシ-N,N-ジメチルプロピルアミン（DLinDAP）、1,2-N,N'-ジリノレイルカルバミル-3-ジメチルアミノプロパン（DLincarbDAP）、1,2-ジリノレオイルカルバミル-3-ジメチルアミノプロパン（DLinCDAP）、2,2-ジリノレイル-4-ジメチルアミノメチル-[1,3]-ジオキソラン（DLin-K-DMA）、2,2-ジリノレイル-4-ジメチルアミノエチル-[1,3]-ジオキソラン（DLin-K-XTC2-DMA）、またはそれらの混合物であり得る。CLinDMAのようなカチオン性脂質は、付加的なカチオン性脂質と共に、米国特許公開第20060240554号に記載されている。DLin-K-DMAのようなカチオン性脂質は、付加的なカチオン性脂質と共に、2008年1月2日出願の米国仮出願第61/018,627号、2008年5月1日出願の米国仮出願第61/049,568号、および2008年10月9日出願の米国仮出願第61/104,219号に記載されている。DLin-K-XTC2-DMAのようなカチオン性脂質は、付加的なカチオン性脂質と共に、2008年10月9日出願の米国仮出願第61/104,212号に記載されている。カチオン性脂質は、粒子中に存在する全脂質の約2モル％〜約60モル％、約5モル％〜約45モル％、約5モル％〜約15モル％、約20モル％〜約50モル％、約30モル％〜約50モル％、約40モル％〜約50モル％、または約40モル％を構成することができる。]
    [0026] 非カチオン性脂質は、ジステアロイルホスファチジルコリン（DSPC）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（DPPC）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（DOPE）、パルミトイルオレオイル-ホスファチジルコリン（POPC）、パルミトイルオレオイル-ホスファチジルエタノールアミン（POPE）、パルミトイルオレイオル-ホスファチジルグリセロール（POPG）、ジパルミトイル-ホスファチジルエタノールアミン（DPPE）、ジミリストイル-ホスファチジルエタノールアミン（DMPE）、ジステアロイル-ホスファチジルエタノールアミン（DSPE）、モノメチル-ホスファチジルエタノールアミン、ジメチル-ホスファチジルエタノールアミン、ジエライドイル-ホスファチジルエタノールアミン（DEPE）、ステアロイルオレオイル-ホスファチジルエタノールアミン（SOPE）、卵ホスファチジルコリン（EPC）、コレステロール、またはそれらの混合物を含むが、これらに限定はされない、アニオン性脂質または中性脂質であり得る。非カチオン性脂質は、粒子中に存在する全脂質の約5モル％〜約90モル％、約10モル％〜約85モル％、約20モル％〜約85モル％、約10モル％（例えば、DSPCもしくはDPPCのようなリン脂質のみ）、または約60モル％（例えば、約10モル％のDSPCもしくはDPPCのようなリン脂質および約48モル％のコレステロール）を構成することができる。]
    [0027] 粒子の凝集を阻害する複合脂質は、ポリエチレングリコール（PEG）-脂質コンジュゲート、ポリアミド（ATTA）-脂質コンジュゲート、カチオン性ポリマー-脂質コンジュゲート（CPL）、またはそれらの混合物であり得る。一つの好ましい態様において、核酸-脂質粒子は、PEG-脂質コンジュゲートまたはATTA-脂質コンジュゲートのいずれかを含む。ある種の態様において、PEG-脂質コンジュゲートまたはATTA-脂質コンジュゲートは、CPLと共に使用される。粒子の凝集を阻害する複合脂質には、例えば、PEG-ジアシルグリセロール（DAG）、PEGジアルキルオキシプロピル（DAA）、PEG-リン脂質、PEG-セラミド（Cer）、またはそれらの混合物を含む、ポリエチレングリコール-脂質コンジュゲートが含まれ得る。PEG-DAAコンジュゲートは、PEG-ジラウリルオキシプロピル（C12）、PEG-ジミリスチルオキシプロピル（C14）、PEG-ジパルミチルオキシプロピル（C16）、およびPEG-ジステアリルオキシプロピル（C18）であり得る。本発明において使用するのに適している付加的なPEG-脂質コンジュゲートには、2008年3月26日出願の米国仮出願第61/039,748号に記載されたPEG-C-DOMG、および米国特許第7,404,969号に記載された1-[8'-(1,2-ジミリストイル-3-プロパンオキシ)-カルボキサミド-3',6'-ジオキサオクタニル]カルバモイル-ω-メチル-ポリ(エチレングリコール)（2KPEG-DMG）が含まれるが、これらに限定はされない。いくつかの態様において、粒子の凝集を阻害する複合脂質は、式：A-W-Y［式中、Aは脂質モエティであり、Wは親水性ポリマーであり、かつYはポリカチオン性モエティである］を有するCPLである。Wは、約250〜約7000ダルトンの分子量を有する、ポリエチレングリコール（PEG）、ポリアミド、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸／ポリグリコール酸コポリマー、またはそれらの組み合わせからなる群より選択されるポリマーであり得る。いくつかの態様において、Yは選択されたpHにおいて少なくとも4価の正の電荷を有する。いくつかの態様において、Yは、リジン、アルギニン、アスパラギン、グルタミン、それらの誘導体、またはそれらの組み合わせであり得る。粒子の凝集を防止する複合脂質は、粒子中に存在する全脂質の0モル％〜約20モル％、約0.5モル％〜約20モル％、約1モル％〜約15モル％、約4モル％〜約10モル％、または約2モル％であり得る。]
    [0028] いくつかの態様において、核酸-脂質粒子は、コレステロールまたはその誘導体をさらに含む。適当なコレステロール誘導体の例には、コレスタノール、コレスタノン、コレステノン、コプロスタノール、コレステリル-2'-ヒドロキシエチルエーテル、およびコレステリル-4'-ヒドロキシブチルエーテルが含まれるが、これらに限定はされない。コレステロールまたはコレステロール誘導体は、粒子中に存在する全脂質の0モル％〜約10モル％、約2モル％〜約10モル％、約10モル％〜約60モル％、約20モル％〜約45モル％、約30モル％〜約50モル％、または約48モル％であり得る。]
    [0029] 本発明の一つの特定の態様において、核酸-脂質粒子は、40モル％のDLinDMA、10モル％のDSPC、2モル％のPEG-cDMA、および48モル％のコレステロールを含む。]
    [0030] 本発明の他の態様において、核酸-脂質粒子は、（a）PLK-1発現をサイレンシングする一つまたは複数の未修飾siRNAおよび／または修飾siRNA；（b）粒子中に存在する全脂質の約50モル％〜約85モル％を構成するカチオン性脂質；（c）粒子中に存在する全脂質の約13モル％〜約49.5モル％を構成する非カチオン性脂質；ならびに（d）粒子中に存在する全脂質の約0.5モル％〜約2モル％を構成し、粒子の凝集を阻害する複合脂質：を含む。好ましい態様において、核酸-脂質粒子中のsiRNAが、水性溶液中でヌクレアーゼによる分解に対して抵抗性であるよう、siRNAは核酸-脂質粒子の脂質に完全に封入される。好ましい態様において、核酸-脂質粒子は、哺乳動物に対して実質的に非毒性である。]
    [0031] これらのSNALP態様において、核酸-脂質粒子は、上記のカチオン性脂質のうちの一つまたは複数を含み得る。好ましい態様において、カチオン性脂質はDLinDMAである。カチオン性脂質は、典型的には、粒子中に存在する全脂質の約50モル％〜約85モル％、約50モル％〜約80モル％、約50モル％〜約75モル％、約50モル％〜約65モル％、または約55モル％〜約65モル％を構成する。]
    [0032] これらのSNALP態様における非カチオン性脂質は、アニオン性脂質または中性脂質であり得る。一つの態様において、非カチオン性脂質は、コレステロールまたはその誘導体を含む。この態様において、コレステロールまたはコレステロール誘導体は、粒子中に存在する全脂質の約30モル％〜約40モル％を構成する。もう一つの態様において、非カチオン性脂質はリン脂質を含む。さらにもう一つの態様において、非カチオン性脂質は、リン脂質とコレステロールまたはコレステロール誘導体との混合物を含む。]
    [0033] これらのSNALP態様において使用するのに適しているリン脂質には、DPPC、DSPC、DOPE、POPC、POPE、POPG、DPPE、DMPE、DSPE、モノメチル-ホスファチジルエタノールアミン、ジメチル-ホスファチジルエタノールアミン、DEPE、SOPE、EPC、およびそれらの混合物が含まれるが、これらに限定はされない。非カチオン性脂質が、リン脂質とコレステロールまたはコレステロール誘導体との混合物である場合、リン脂質は、粒子中に存在する全脂質の約4モル％〜約10モル％を構成し、コレステロールまたはコレステロール誘導体は、粒子中に存在する全脂質の約30モル％〜約40モル％を構成する。コレステロール誘導体が使用される場合、コレステロール誘導体には、コレスタノール、コレスタノン、コレステノン、コプロスタノール、コレステリル-2'-ヒドロキシエチルエーテル、およびコレステリル-4'-ヒドロキシブチルエーテルが含まれるが、これらに限定はされない。好ましい態様において、リン脂質にはDPPCが含まれる。]
    [0034] これらの態様のSNALPは、粒子の凝集を阻害する複合脂質も含むことができる。適当な複合脂質の例には、PEG-脂質コンジュゲート、ポリアミド（ATTA）-脂質コンジュゲート、カチオン性ポリマー-脂質コンジュゲート（CPL）、またはそれらの混合物が含まれるが、これらに限定はされない。一つの好ましい態様において、核酸-脂質粒子はPEG-脂質コンジュゲートまたはATTA-脂質コンジュゲートのいずれかを含む。ある種の態様において、PEG-脂質コンジュゲートまたはATTA-脂質コンジュゲートは、CPLと共に使用される。好ましい態様において、複合脂質はPEG-脂質である。]
    [0035] 適当なPEG-脂質の例には、PEG-DAG、PEG-DAA、PEG-リン脂質、PEG-セラミド（Cer）、またはそれらの混合物が含まれるが、これらに限定はされない。好ましい態様において、PEG-脂質はPEG-DAAコンジュゲートである。適当なPEG-DAAコンジュゲートの例には、PEG-ジラウリルオキシプロピル（C12）、PEG-ジミリスチルオキシプロピル（C14）、PEG-ジパルミチルオキシプロピル（C16）、およびPEG-ジステアリルオキシプロピル（C18）が含まれるが、これらに限定はされない。好ましい態様において、PEG-DAAコンジュゲートはPEG-ジミリスチルオキシプロピル（C14）である。もう一つの好ましい態様において、PEG-DAAコンジュゲートはPEG-ジステアリルオキシプロピル（C18）である。付加的なPEG-脂質コンジュゲートには、非限定的に、PEG-C-DOMG、2KPEG-DMG、およびそれらの混合物が含まれる。複合脂質は、典型的には、粒子中に存在する全脂質の約0.5モル％〜約2モル％を構成する。]
    [0036] 典型的には、これらの態様のSNALPは、約1〜約100の脂質:核酸比を有する。好ましい態様において、これらのSNALPは、約5〜約15の脂質:核酸比を有する。もう一つの好ましい態様において、これらのSNALPは、約6の脂質:核酸比を有する。典型的には、これらのSNALPは、約50nm〜約150nmの平均直径を有する。好ましい態様において、これらのSNALPは、約70nm〜約90nmの平均直径を有する。]
    [0037] 本発明の一つの特定の態様において、SNALPは、（a）PLK-1発現をサイレンシングする一つまたは複数の未修飾siRNAおよび／または修飾siRNA；（b）粒子中に存在する全脂質の約56.5モル％〜約66.5モル％を構成するカチオン性脂質；（c）粒子中に存在する全脂質の約31.5モル％〜約42.5モル％を構成する非カチオン性脂質；ならびに（d）粒子中に存在する全脂質の約1モル％〜約2モル％を構成し、粒子の凝集を阻害する複合脂質：を含む。SNALPのこの態様は、一般に、本明細書において「1:62」製剤と呼ばれる。好ましい態様において、カチオン性脂質はDLinDMAであり、非カチオン性脂質はコレステロールであり、複合脂質はPEG-DAAコンジュゲートである。これらが1:62製剤の好ましい態様であるが、他のカチオン性脂質、他のコレステロール誘導体を含む非カチオン性脂質、および複合脂質が、本明細書に記載されるような1:62製剤において使用されてもよいことを、当業者は認識するであろう。]
    [0038] 本発明のもう一つの特定の態様において、SNALPは、（a）PLK-1発現をサイレンシングする一つまたは複数の未修飾siRNAおよび／または修飾siRNA；（b）粒子中に存在する全脂質の約52モル％〜約62モル％を構成するカチオン性脂質；（c）粒子中に存在する全脂質の約36モル％〜約47モル％を構成する非カチオン性脂質；ならびに（d）粒子中に存在する全脂質の約1モル％〜約2モル％を構成し、粒子の凝集を阻害する複合脂質：を含む。SNALPのこの態様は、一般に、本明細書において「1:57」製剤と呼ばれる。好ましい態様において、カチオン性脂質はDLinDMAであり、非カチオン性脂質は（DPPCのような）リン脂質とコレステロールとの混合物であり［リン脂質は、粒子中に存在する全脂質の約5モル％〜約9モル％を構成し、コレステロール（またはコレステロール誘導体）は、粒子中に存在する全脂質の約32モル％〜約37モル％を構成する］、PEG-脂質はPEG-DAAである。これらが1:57製剤の好ましい態様であるが、他のカチオン性脂質、（他のリン脂質および他のコレステロール誘導体を含む）非カチオン性脂質、ならびに複合脂質が、本明細書に記載されるような1:57製剤において使用されてもよいことを、当業者は認識するであろう。]
    [0039] いくつかの態様において、核酸-脂質粒子は、表1〜7および10〜11に示された配列を含むかまたはからなる未修飾siRNA分子または修飾siRNA分子を、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、またはそれ以上含む。他の態様において、核酸-脂質粒子は、PLK1424 U4/GU、PLK1424 U4/G、PLK773 G/GU、PLK1425 3/5、およびそれらの混合物からなる群より選択される修飾siRNA分子を含む。]
    [0040] 本発明の核酸-脂質粒子は、PLK-1発現をサイレンシングするsiRNA分子の治療的送達のために有用である。一つの態様において、本明細書に記載された修飾siRNA分子が、核酸-脂質粒子へと製剤化され、粒子が、そのような処置を必要とする哺乳動物（例えば、マウスのようなげっ歯類、またはヒト、チンパンジー、もしくはサルのような霊長類）へ投与される。ある種の例において、治療的に有効な量の核酸-脂質粒子が、例えば、肝細胞癌（HCC）のような癌を処置するため、哺乳動物へ投与され得る。核酸-脂質粒子の投与は、例えば、経口、鼻腔内、静脈内、腹腔内、筋肉内、関節内、病巣内、気管内、皮下、または皮内のような、当技術分野において公知の任意の経路によることができる。]
    [0041] ある種の態様において、核酸-脂質粒子中のsiRNA分子は、少なくとも20分間、30分間、45分間、もしくは60分間の37℃でのヌクレアーゼへの粒子の曝露の後、または少なくとも30分間、45分間、もしくは60分間、もしくは少なくとも2時間、3時間、4時間、5時間、6時間、7時間、8時間、9時間、10時間、12時間、14時間、16時間、18時間、20時間、22時間、24時間、26時間、28時間、30時間、32時間、34時間、もしくは36時間の37℃での血清中での粒子のインキュベーションの後、実質的に分解されない。]
    [0042] いくつかの態様において、siRNA分子は、核酸-脂質粒子に完全に封入される。他の態様において、siRNA分子は粒子の脂質部分と複合体化される。]
    [0043] 本発明は、本明細書に記載された核酸-脂質粒子と薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物をさらに提供する。]
    [0044] さらにもう一つの局面において、本明細書に記載されたsiRNA分子は、PLK-1発現をサイレンシングする方法において使用される。特に、PLK-1遺伝子の転写および／または翻訳をダウンレギュレートするかまたはサイレンシングすることによる、哺乳動物における疾患または障害の処置のためのインビトロおよびインビボの方法を提供することが、本発明の目的である。一つの態様において、本発明は、細胞を、本明細書に記載されたsiRNA分子と接触させることによる、PLK-1遺伝子の発現（例えば、mRNAおよび／またはタンパク質のレベル）をサイレンシングするsiRNAを細胞へ導入する方法を提供する。もう一つの態様において、本発明は、本明細書に記載されたsiRNA分子を哺乳動物へ投与することによる、PLK-1遺伝子の発現をサイレンシングするsiRNA分子のインビボ送達の方法を提供する。siRNA分子の投与は、例えば、経口、鼻腔内、静脈内、腹腔内、筋肉内、関節内、病巣内、気管内、皮下、または皮内のような、当技術分野において公知の任意の経路によることができる。]
    [0045] これらの方法において、PLK-1発現をサイレンシングするsiRNA分子は、典型的には、担体系を用いて製剤化され、siRNA分子を含む担体系が、そのような処置を必要とする哺乳動物へ投与される。または、ヒトなどの哺乳動物から細胞を取り出し、担体系を使用してsiRNAをインビトロで送達し、次いで、その細胞を注射等により哺乳動物へ投与する。本発明において使用するのに適している担体系の例には、核酸-脂質粒子、リポソーム、ミセル、ビロソーム、核酸複合体（例えば、リポプレックス、ポリプレックス等）、およびそれらの混合物が含まれるが、これらに限定はされない。担体系は、PLK-1発現をサイレンシングするsiRNA分子を少なくとも一つ含んでいてもよいし、またはそれらのカクテル（例えば、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、またはそれ以上）を含んでいてもよい。ある種の態様において、担体系は、表1〜7および10〜11に示された配列の少なくとも一つ、またはそれらのカクテルを含む。]
    [0046] いくつかの態様において、PLK-1発現をサイレンシングするsiRNA分子は、siRNA分子、カチオン性脂質、および非カチオン性脂質を含む核酸-脂質粒子の中にある。好ましくは、siRNA分子は、siRNA分子、カチオン性脂質、非カチオン性脂質、および粒子の凝集を阻害する複合脂質を含む核酸-脂質粒子の中にある。治療的に有効な量の核酸-脂質粒子が、哺乳動物（例えば、マウスのようなげっ歯類、またはヒト、チンパンジー、もしくはサルのような霊長類）へ投与され得る。]
    [0047] いくつかの態様において、哺乳動物は細胞増殖性障害を有する。この態様のある種の局面において、哺乳動物は、新生物（例えば、癌）、過形成、再狭窄、心肥大、免疫障害、および炎症からなる群より選択される細胞増殖性障害を有する。好ましくは、細胞増殖性障害は、癌のような新生物障害である。いくつかの態様において、癌には、肝細胞癌（HCC）、乳頭腫、ブラストグリオーマ（blastoglioma）、カポジ肉腫、黒色腫、肺癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、星状細胞腫、頭部癌、頚部癌、膀胱癌、乳癌、肺癌、結腸直腸癌、甲状腺癌、膵臓癌、胃癌、白血病、リンパ腫、ホジキン病、骨肉腫、精巣癌、およびバーキット病が含まれるが、これらに限定はされない。]
    [0048] 一つの態様において、核酸-脂質粒子の全注射用量の少なくとも約1％、2％、4％、6％、8％、10％、12％、14％、16％、18％、または20％が、注射の約1時間後、2時間後、4時間後、6時間後、8時間後、12時間後、16時間後、18時間後、または24時間後に、血漿中に存在する。他の態様において、核酸-脂質粒子の全注射用量の約20％超、30％超、40％超、または60％、70％、または80％もが、注射の約1時間後、4時間後、6時間後、8時間後、10時間後、12時間後、20時間後、または24時間後に、血漿中に存在する。もう一つの態様において、投与の部位に対して近位または遠位の部位におけるsiRNA分子の効果（例えば、標的PLK-1配列のダウンレギュレーション）は、核酸-脂質粒子の投与の約12時間後、24時間後、48時間後、72時間後、もしくは96時間後、または約6日後、8日後、10日後、12日後、14日後、16日後、18日後、19日後、20日後、22日後、24日後、26日後、もしくは28日後に検出可能である。さらなる態様において、標的PLK-1配列の発現のダウンレギュレーションは、投与の約12時間後、24時間後、48時間後、72時間後、もしくは96時間後、または約6日後、8日後、10日後、12日後、14日後、16日後、18日後、19日後、20日後、22日後、24日後、26日後、もしくは28日後に検出可能である。いくつかの態様において、PLK-1遺伝子のダウンレギュレーションは、哺乳動物に由来する生物学的試料の中のmRNAまたはタンパク質のレベルを検出することにより決定される。他の態様において、PLK-1配列の発現のダウンレギュレーションは、哺乳動物に由来する生物学的試料の中の細胞の生存性または細胞のアポトーシスの誘導を測定することにより検出される。]
    [0049] 核酸-脂質粒子は、循環系において安定しており、血管外部位および標的細胞集団への接近をもたらす薬力学的挙動のために必要とされるサイズを有しているため、静脈内核酸送達において使用するのに適している。本発明は、核酸-脂質粒子を含む薬学的に許容される組成物も提供する。]
    [0050] さらなる局面において、本明細書に記載されたsiRNA分子は、化学療法薬の効果に対して細胞を感作する方法において使用される。特に、化学療法薬の投与と組み合わせられた、PLK-1遺伝子の転写および／または翻訳をダウンレギュレートするかまたはサイレンシングすることによる、哺乳動物における細胞増殖性障害の処置のためのインビトロおよびインビボの方法を提供することが、本発明の目的である。本明細書に詳細に記載されるように、ヒトのような哺乳動物は、化学療法薬投与の前、間、および／または後に、適当な用量の（例えば、核酸-脂質粒子へ製剤化された）一つまたは複数の未修飾siRNA分子または修飾siRNA分子により処置され得る。好ましい態様において、ヒトのなどの哺乳動物における癌細胞のなどの細胞は、化学療法薬を投与する前に、PLK-1発現をサイレンシングするsiRNAと接触させられる。]
    [0051] 付加的な局面において、本発明は、PLK-1発現を標的とする本明細書に記載された非対称干渉RNA（aiRNA）分子を含む組成物、およびPLK-1発現をサイレンシングするためのそのような組成物の使用法を提供する。]
    [0052] 関連する局面において、本発明は、PLK-1発現を標的とする本明細書に記載されたマイクロRNA（miRNA）分子を含む組成物、およびPLK-1発現をサイレンシングするためのそのような組成物の使用法を提供する。]
    [0053] 本発明のその他の目的、特色、および利点は、以下の詳細な説明および図面より、当業者に明白になるであろう。]
    図面の簡単な説明

    [0054] HT29細胞およびNeuro2A細胞における選択されたSNALP製剤化PLK-1 siRNA配列のRNAi活性を証明するデータを例示する。
    細胞生存性に対するPLK-1 SNALPの強力な効果が、PLK-1mRNAのサイレンシングによることを証明するデータを例示する。
    HT29細胞およびNeuro2A細胞における付加的なSNALP製剤化PLK-1 siRNA配列のRNAi活性を証明するデータを例示する。
    HT29細胞およびLS174T細胞におけるSNALP製剤化されたPLK1424およびPLK773の活性を証明するデータを例示する。
    SNALP製剤化されたPLK1424およびPLK773が、LS174T細胞においてアポトーシスを誘導することを証明するデータを例示する。
    HT29細胞およびNeuro2A細胞における付加的なSNALP製剤化PLK-1 siRNA配列のRNAi活性を証明するデータを例示する。
    PLK1424 siRNA配列における異なる2'OMe修飾パターンがよく耐容され、修飾siRNA分子が強力な活性を保持していたことを証明するデータを例示する。
    2'OMe修飾PLK1424 siRNAが、マウスFLT3L DC培養物において検出可能なIL-6またはIFN-αの応答を誘導しなかったことを証明するデータを例示する。
    PLK773 siRNA配列における異なる2'OMe修飾パターンがよく耐容され、修飾siRNA分子が強力な活性を保持していたことを証明するデータを例示する。
    PLK1425 siRNA配列における異なる2'OMe修飾パターンがよく耐容され、修飾siRNA分子が強力な活性を保持していたことを証明するデータを例示する。
    PLK-1 SNALPおよびパクリタクセル（タキソール）による逐次組み合わせ処理が、Neuro2A細胞およびHepG2細胞の成長の阻害を有意に増強したことを証明するデータを例示する。
    PLK-1 SNALPおよびパクリタクセル（タキソール）による逐次組み合わせ処理が、Neuro2A細胞において誘導されるアポトーシスのレベルを有意に増強したことを証明するデータを例示する。
    Hep3B肝臓腫瘍を保持しているマウスにおいて、SNALP製剤化PLK1424の処理計画が、処理に関連した毒性の明白な兆候なしに、よく耐容されることを証明するデータを例示する。
    SNALP製剤化PLK1424による処理が、Hep3B腫瘍保持マウスの生存の有意な増加を引き起こしたことを証明するデータを例示する。
    SNALP製剤化PLK1424による処理が、SNALP投与の24時間後に、マウスにおいて成長中の肝臓内Hep3B腫瘍におけるPLK-1 mRNAレベルを50％低下させたことを証明するデータを例示する。
    PLK1424 SNALPにより処理されたマウスにおいて、PLK-1 mRNAの特異的切断産物が5'RACE-PCRにより検出可能であったことを証明するデータを例示する。10μlのPCR産物／ウェルを、1.5％アガロースゲルに負荷した。レーン番号：（1）分子量（MW）マーカー；（2）PBSマウス1；（3）PBSマウス2；（4）PBSマウス3；（5）Luc SNALPマウス1；（6）Luc SNALPマウス2；（7）PLK SNALPマウス1；（8）PLK SNALPマウス2；（9）PLK SNALPマウス3；および（10）鋳型を含まない対照。
    対照（Luc）SNALP処理マウスは、Hep3B腫瘍において正常な有糸分裂を示したが（上パネル）、PLK1424 SNALP処理マウスは、Hep3B腫瘍において多数の異常な有糸分裂および腫瘍細胞アポトーシスを示した（下パネル）ことを証明するデータを例示する。
    PEG-cDSAを含有している1:57 PLK-1 SNALPの複数回投与が、確立されたHep3B皮下（S.C.）腫瘍の退行を誘導したことを証明するデータを例示する。
    単回静脈内SNALP投与後のS.C.Hep3B腫瘍における1:57 PLK SNALPのmRNAサイレンシングを証明するデータを例示する。
    PLK1-cDSA SNALPが大きいS.C.Hep3B腫瘍の成長を阻害したことを証明するデータを例示する。
    Hep3B肝臓内腫瘍における腫瘍由来PLK-1 mRNAのサイレンシングを証明するデータを例示する。
    PEG-cDMAまたはPEG-cDSAのいずれかを含有している1:57 PLK-1 SNALPの血液クリアランスプロフィールを証明するデータを例示する。
    PLK-1 siRNA配列のインビトロ活性スクリーニングを証明するデータを例示する。ヒトPLK-1 mRNAを標的とするネイティブPLK-1 siRNA配列の活性を、HT29細胞生存性アッセイにおいて判定した。細胞を、1nM（白色バー）、5nM（灰色バー）、および25nM（黒色バー）のSNALP製剤化されたPLK-1 siRNAまたはLuc siRNAにより処理した。細胞生存性を、CellTiter Blueレサズリン色素を使用して、72時間後に判定した。2ラウンドのsiRNA設計（A＆B、C）を実施した。配列番号は、hPLK-1 mRNAオープンリーディングフレーム（Genbankアクセッション番号NM_005030）におけるsiRNA標的部位を表す。
    インビトロのPLK-1 siRNAの活性を証明するデータを例示する。（A）PLK1424処理、（B）PLK773処理、または（C）Luc siRNA処理に関する、mRNAサイレンシングとHT29細胞生存性との間の相関。PLK-1 mRNAは24時間後にbDNA分析により決定された。デュプリケートプレートが72時間後に細胞生存性に関して判定された。（D）PLK1424 siRNAは、LS 174T細胞、HT29細胞、Hep3B細胞、およびHepG2細胞の培養物の生存性の用量依存的な低下を引き起こす。細胞は、5nM（黒色バー）、2.5nM、1.25nM、0.63nM、および0.31nM（白色バー）siRNAのPLK1424 SNALPにより72時間処理された。（A）〜（D）の値は、PBS対照と比べた生存性またはPLK-1 mRNA（％）として表されており、トリプリケート培養物において実施された三つの別々の実験の平均値（+/- SD）を反映している。（E）減少した細胞生存性は、アポトーシスの誘導に関連している。SNALPに封入されたPLK773、PLK1424、またはLuc対照siRNAによる処理の24時間後および48時間後に、LS 174T細胞におけるカスパーゼ3/7活性が判定された。データは、トリプリケート培養物におけるPBSに対する誘導の倍率（トリプリケート培養物の平均値+/- SD）を表している。
    SNALP製剤化siRNAにより誘導されるインターフェロン応答のインビボ特徴決定を証明するデータを例示する。（a）SNALP製剤化ネイティブ（未修飾）ApoB1 siRNAのi.v.投与後の血清IFNαおよび肝臓IFIT1 mRNAの誘導の時間経過。Balb/cマウス（各群n＝4）に2.5mg/kgのsiRNAまたは脂質媒体を投与し；4時間後、8時間後、および16時間後に、血清IFNα（pg/mL）および完全肝臓溶解物由来のIFIT1 mRNA（GAPDHに対して）を、それぞれELISAおよびbDNAアッセイにより判定した。（b、c）標的組織におけるIFIT1 mRNA誘導の測定は、siRNAの残余の免疫刺激活性を解明することができる。マウスを、ネイティブApoB-1 siRNA、またはセンス（S）鎖もしくは両方の鎖（S＋AS）のいずれかに選択的な2'OMeヌクレオチドを含有しているApoB-1 siRNAにより処理した。（b）血清IFNαおよび（c）肝臓IFIT1 mRNAを、投与の4時間後に判定した（平均値＋SD、n＝4）。ApoB-1 2'OMe(S)処理マウスにおいては、IFIT1 mRNA誘導により、全身性サイトカイン誘導の非存在下での残余の免疫刺激活性が認められた。この応答は、siRNA二重鎖のAS鎖への付加的な2'OMeヌクレオチドの組み込みによって完全に抑止された。全てのsiRNAが、完全なRNAi活性を保持していた。
    2'OMe修飾されたPLK-1 siRNAおよびKSP siRNAの、未修飾siRNAと比較したインビトロ活性を証明するデータを例示する。（A）PLK1424 siRNAおよび（B）PLK773 siRNAの2'OMe修飾パネルの活性。未修飾のPLK1424 siRNAまたはPLK773 siRNA（黒）を、Hep3B細胞生存性アッセイにおいて、それぞれの2'OMeセンス／アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む2'OMe修飾二重鎖1/A、2/A、1/B、2/B、1/C、または2/C（表6参照）と比較した。データは、PBS処理細胞と比べたトリプリケート培養物の平均生存性であり、SNALP製剤化siRNAを使用した二つの独立の実験を表している。（C）インビトロの未修飾PLK-1 siRNAおよび2'OMe PLK-1 siRNAによるサイトカイン誘導。マウスFlt3L DCを、SNALPへ製剤化された5μg/mLの未修飾のPLK773もしくはPLK1424 siRNA二重鎖（773、1424）およびそれらを構成するセンス（S）もしくはアンチセンス（AS）オリゴヌクレオチド、または2'OMe siRNA二重鎖PLK773-1/BおよびPLK1424-2/Aにより処理した。24時間後、培養上清中のIFNαおよびIL-6をアッセイした。値は、トリプリケート培養物において実施された三つの別々の実験の平均値＋SDである。（D、E）マウスNeuro2a細胞におけるSNALP製剤化KSP2263 siRNAの活性。（D）PBS対照に対して相対的なKSP mRNAサイレンシングと細胞生存性との間の相関。KSP mRNAは、24時間後にbDNA分析により決定された。デュプリケートプレートが、72時間後に、細胞生存性に関して判定された。（E）Neuro2a細胞生存性アッセイにおいて、未修飾KSP2263 siRNAを、2'OMe修飾二重鎖（表6参照）のパネルと比較した活性スクリーニング。データは、PBS処理と比べたトリプリケート培養物の平均値+/- SDを表す。
    インビトロの5'RACE-PCRによるPLK1424およびKSP2263に特異的なmRNA切断産物の検出を証明するデータを例示する。（A）HT29細胞を、10nMのSNALP製剤化されたPLK1424、Luc siRNA、またはPBSにより処理した。トランスフェクションの24時間後にRNAを単離し、5'-RACE-PCRにより、特異的なPLK-1 mRNA切断産物に関してアッセイした。（B）Neuro2a細胞を、SNALP製剤化されたKSP2263 siRNA、PLK773 siRNA、またはPBSにより処理した。トランスフェクションの24時間後にRNAを単離し、5'-RACE-PCRにより、特異的なマウスKSP mRNA切断産物に関してアッセイした。RNAi特異的な476bpのPLK-1 mRNA切断産物および102bpのKSP mRNA切断産物の同一性は、直接オリゴヌクレオチド配列決定により確認された。
    2'OMe修飾されたPLK-1 siRNA、KSP siRNA、またはLuc siRNAが、マウスにおいて測定可能なIFN応答を誘導しないことを証明するデータを例示する。SNALP製剤化されたLuc（未修飾）siRNA、および2'OMe修飾されたLuc-U/U siRNA、PLK1424-2/A siRNA、PLK773-1/B siRNA、またはKSP2263-U/U siRNAを、Balb/Cマウスへ2mg/kgでi.v.投与した。（A）4時間後に、bDNA分析により、肝臓および脾臓におけるIFIT1 mRNAをGAPDH mRNAと比べて判定した。（B）6時間後に、血清IFNαをELISAにより判定した。SNALP製剤化2'OMe siRNAは、PBS媒体と比べて、IFNαタンパク質またはIFIT1 mRNAの検出可能な増加を誘導しなかった。値は平均値＋SD（n＝4）を表す。
    肝臓腫瘍におけるPLK-1 siRNAおよびKSP siRNAの治療活性を証明するデータを例示する。PLK1424-2/A処理は、肝臓Hep3B腫瘍を保持しているスキッド（scid）／ベージュ（beige）マウスにおいて有意な生存有利を付与する。マウスに、週2回（10日目〜28日目）、6×2mg/kgで、SNALP製剤化されたPLK1424-2/A（n＝15）またはLuc-U/U（n＝8）を静脈内投与した。（A）10日目の初期体重に対する％として表された投薬期間中の体重（平均値＋SD）。（B）腫瘍負荷による安楽死までの日数のカプランマイヤープロット。PLK1424-2/A処理は、対照処理と比べて有意な生存有利を提供した（p＝0.03、ログランクマンテルコックス検定）。（C）PLK1424-2/A siRNA（8日目、11日目、14日目、18日目、および21日目に5×2mg/kg siRNA）の最終投与の24時間後のマウスにおける残余肝臓Hep3B腫瘍負荷。バーは、ヒト特異的bDNAアッセイにより決定された個々のマウスの肝臓1mg当たりのhGAPDH mRNA（トリプリケート分析の平均値+/- SD）を表す（腫瘍なし＝腫瘍未接種マウスに由来する肝臓）。付加的なデータに関しては、図32を参照すること。（D）KSP2263-U/U処理は、肝臓Neuro2a腫瘍を保持しているA/Jマウスにおいて生存有利を付与する。マウスに、5×4mg/kgで、SNALP製剤化されたKSP2263-U/UまたはLuc-U/U（n＝8）を静脈内投与した（腫瘍接種後8日目〜21日目、3日毎×5）。腫瘍負荷および終点による安楽死までの日数のカプランマイヤープロットは、生存に関する人道的サロゲートとしての臨床的スコアに基づく。PLK1424製剤およびLuc製剤に関して、平均SNALP粒子サイズおよび（多分散）は、それぞれ、83（0.09）nmおよび90（0.12）nmであった。
    PLK1424 SNALPが肝臓Hep3B-nu/nuマウスモデルにおいて有意な生存有利を付与することを証明するデータを例示する。確立された肝臓腫瘍を保持しているマウスを、PLK1424-2/A SNALPまたはLuc-U/U SNALP（腫瘍接種後11日目〜28日目、週2回、2mg/kg）により処理し、人道的終点により定義された安楽死まで腫瘍負荷に関してモニタリングした。データは二つの独立の研究を表す。PLK1424対Lucの生存中央値は、研究（A）においては45日目および67日目にそれぞれp＝0.02、研究（B）においては42日目および不確定日にそれぞれp＝0.008であった（ログランクマンテルコックス検定）。80日目を越えて生存した動物は、全て、100日目の研究終了時に、腫瘍なしであることが見出された。
    PLK1424-2/A SNALPが、投薬完了後に巨視的な腫瘍負荷を有意に低下させることを証明するデータを例示する。結果は、図37Cに記載された個々のマウスに由来するものである。肝左葉外側区域に巨視的な腫瘍負荷を示す（A）PBS対照および（B）PLK1424-2/A SNALPにより処理されたマウスに由来する肝臓。（C）腫瘍接種後8日目〜21日目の研究期間中の（A）および（B）に示された個々のマウスの体重。個々のマウスにおいて、体重減少は、腫瘍負荷と直接相関した。
    PLK-1 SNALPがマウスにおいてよく耐容されることを証明するデータを例示する。PLK-1サイレンシングまたは脂質媒体のいずれかに関連した可能性のある累積毒性を判定するため、CD1 ICRマウスの群に、PBS、PLK773-1/B SNALP、またはLuc-U/U SNALPを投与した。腫瘍研究における有効な投薬計画と等価な2mg/kg siRNAで、週2回、マウスを処理した。臨床化学および全血球数を、5回目（15日目）および9回目（29日目）の24時間後に評価した。siRNA処理は、15日処理期間でも29日処理期間でも、（A）血清肝酵素アラニンアミノトランスフェラーゼ（ALT）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（AST）、またはソルビトールデヒドロゲナーゼ（SDH）；（B）全wbc数、リンパ球数、または好中球数、および（C）血小板数の有意な変化を誘導しなかった。全ての値が平均値+/- SD（n＝6）である。赤血球パラメーターの変化は観察されなかった。
    RNAi機序による肝臓腫瘍における標的mRNAサイレンシングを証明するデータを例示する。SNALP製剤化siRNA投与後の腫瘍における（A、B）標的mRNAサイレンシングおよび（C、D）RNAi特異的なmRNA切断産物の検出。確立された肝臓内Hep3B腫瘍を有するスキッド／ベージュマウスに、2mg/kg用量のSNALP製剤化されたPLK1424-2/A siRNAまたはLuc-U/U siRNAを単回投与し、RNAi活性を（A）腫瘍溶解物中のPLK-1 mRNAおよび（C）5'RACE-PCR分析により判定した。（A）siRNA投与の24時間後の腫瘍（ヒト）PLK-1:GAPDH mRNA比（4匹の動物の平均値+/- SD）。（C）RACE-PCRは、（A）において分析された腫瘍に由来するPLK-1 mRNAの特異的な5'切断産物を検出する。レーンは、個々のPBS（n＝2）、Luc-U/U（n＝2）、およびPLK1424-2/A（n＝3）により処理されたマウスに由来するPCR産物を表す。SNALP製剤化KSP2263-U/U siRNAにより処理されたマウスから切除された肝臓Neuro2a腫瘍の（B）マウスKSP mRNAおよび（D）5'RACE-PCR分析。データは（A）および（C）と同様に表されている。＋＝KSP2263-U/U siRNAにより処理されたインビトロNeuro2a細胞溶解物に由来する陽性対照；−＝鋳型を含まない対照。RACE-PCRは、腫瘍に由来するマウスKSP mRNAの特異的な5'切断産物を検出する。予測された476bpのPLK-1 PCR産物および102bpのKSP PCR産物（矢印）の同一性は、直接DNA配列決定により確認された。PLK1424、Luc、およびKSP2263の製剤に関して、平均SNALP粒子サイズおよび（多分散）は、それぞれ、83（0.09）nm、90（0.12）nm、および88（0.07）nmであった。
    肝臓腫瘍内のRNAi活性の継続時間を証明するデータを例示する。（A）SNALP製剤化PLK1424-2/A siRNA（2mg/kg）の単回静脈内投与の24時間後、48時間後、96時間後、7日後、および10日後のHep3B肝臓腫瘍の5'-RACE-PCR分析。PLK1424特異的RACE-PCR産物（矢印）の特異性は、1日目および7日目に配列決定により確認された。（B）（A）において分析された単離された腫瘍RNAにおける対応するPLK-1 mRNAのレベル。RNAiの継続時間は、Luc-U/U SNALP処理マウスと比較されたmRNAサイレンシングの継続時間と相関した。データは、平均hPLK-1:hGAPDH mRNA比＋SD（各時点n＝3）を表す。PLK1424およびLucに関して、平均SNALP粒子サイズおよび（多分散）は、それぞれ、83（0.09）nmおよび90（0.12）nmであった。
    KSP2263 siRNAによる単星状体紡錘体形成の誘導を証明するデータを例示する。HeLa細胞を、20nMの（A）Luc siRNAまたは（B）KSP2263 siRNAにより16時間処理し、次いで、α-チューブリン（FITC）に関して免疫染色した。DNAをDAPIで染色し、蛍光画像を捕獲し、重ね合わせた。対照細胞は、KSP2263処理細胞における単星状体紡錘体と比較して、中期での正常な双極紡錘体を示す。
    KSP2263-U/Uが肝臓腫瘍細胞におけるKSP阻害に典型的な明瞭な表現型変化を誘導することを証明するデータを例示する。SNALPへ製剤化された（A）Luc-U/U siRNAまたは（B）KSP2263-U/U siRNA（2mg/kg siRNA）の単回静脈内投与の24時間後の肝臓Neuro2a腫瘍組織学。画像は、200倍の拡大率であり、少なくとも6匹の個々のマウスに由来する腫瘍を代表している。ヘマトキシリンおよびエオシン（H＆E）染色は、KSP2263-U/U処理マウスにおいて、単星状体紡錘体に典型的な異常な核形またはアポトーシス表現型を有する腫瘍細胞を明らかにしている。（C）4mg/kg、2mg/kg、1mg/kg、または0.5mg/kg siRNAのSNALP製剤化KSP2263-U/Uにより処理されたマウスに由来するH＆E染色腫瘍組織の定量的組織学。凝縮クロマチン構造を有する腫瘍細胞を陽性と判定し、10個の視野より得られた全腫瘍細胞に対する％として計算した。陽性細胞は、異常な有糸分裂および典型的な有系分裂ならびにアポトーシスの形状を含んでいた。値は3匹のマウスの平均値＋SDである。KSP2263およびLucに関して、平均SNALP粒子サイズおよび（多分散）は、それぞれ、88（0.07）nmおよび82（0.08）nmであった。
    PLK1424-2Aが、肝臓腫瘍細胞において、PLK-1阻害に典型的な明瞭な表現型変化を誘導することを証明するデータを例示する。2mg/kgのSNALP製剤化された（A、C）Luc-U/U siRNAまたは（B、D）PLK1424-2/A siRNAの単回静脈内投与の24時間後のH＆E腫瘍組織学。（A、B）200倍および（C、D）400倍の拡大率での画像は、少なくとも7匹の個々のマウスに由来する腫瘍の代表である。PLK1424およびLucに関して、平均SNALP粒子サイズおよび（多分散）は、それぞれ、72（0.04）nmおよび72（0.02）nmであった。
    肝臓腫瘍モデルにおけるPEG-cDMAまたはPEG-cDSAのいずれかを含むPLK1424 SNALPの比較を証明するデータを例示する。（A）マウスにおけるIV投与後のPEG-cDMAまたはPEG-cDSAのいずれかを含む3H標識SNALPの血液クリアランス（Judge et al.,Mol.Ther.,13:328-337(2006)による）。データは、注射の0.25時間後、0.5時間後、1時間後、2時間後、4時間後、および8時間後に全血中に残存している注射用量に対する平均％（+/- SD、n＝4）として表されている。（B）いずれかのPLK1424-2/A SNALP製剤の単回2mg/kg投与の24時間後の肝臓Hep3B腫瘍におけるPLK-1 mRNAサイレンシング（平均PLK1:GAPDH比+/- SD、n＝4マウス）。（C）PEG-cDMAまたはPEG-cDSAのいずれかを含むPLK1424-2/A SNALPによる処理は、肝臓内Hep3B腫瘍を保持しているスキッド／ベージュマウスにおいて有意な生存有利を付与する。接種後10日目〜28日目、週2回（6回）、2mg/kgで、PEG cDMAもしくはPEG-cDSAを含むPLK1424-2/A SNALP、またはLuc-U/U SNALP（PEG-cDMA）をマウスに投与した。腫瘍負荷による安楽死までの時間を、生存に対する人道的サロゲートとして臨床的スコアに基づき判定した。両方のPLK1424-2/A SNALP組成物が、対照と比べて有意な生存利点を提供した（p＜0.05、ログランクマンテルコックス検定）。
    皮下腫瘍におけるC14 PEG-脂質またはC18 PEG-脂質のいずれかを含有しているPLK-1 SNALPの治療活性を証明するデータを例示する。（A）代替的なPLK1424-2/A SNALP製剤による皮下腫瘍成長の阻害。Hep3B腫瘍接種後10日目〜21日目に、PEG-cDMAまたはPEG-cDSAのいずれかを含むPLK1424-2/A SNALPを、マウスに投与した（6×2mg/kg、静脈内）。値は平均腫瘍体積（mm3）+/- SD（n＝5）である。対照＝Luc-U/U siRNA SNALP（PEG-cDMA）。（B）PLK1424-2/A siRNAまたはLuc-U/U siRNAの単回投与（2mg/kg）後の皮下Hep3B腫瘍における対応するhPLK-1:hGAPDH mRNA比；平均値＋SD（n＝4）。（C）Hep3B腫瘍におけるPLK1424-2/A PEG-cDSA SNALPの用量応答。接種後18日目〜29日目の間、確立された（およそ100mm3）腫瘍を保持しているマウスに、2〜3日毎に、PLK1424-2/A PEG-cDSA SNALP（6×3mg/kg、1mg/kg、もしくは0.5mg/kg）、Luc PEG-cDSA SNALP（6×3mg/kg）、またはPBS媒体を投与した。値は平均腫瘍体積（mm3）（n＝5）を表す。PLK1424 PEG-cDMA、PLK1424 PEG-cDSA、Luc PEG-cDMA、およびLuc PEG-cDSAに関して、平均SNALP粒子サイズおよび（多分散）は、それぞれ、81（0.10）nm、71（0.03）nm、82（0.12）nm、および74（0.05）nmであった。
    PLK1424 siRNA配列における異なる化学的修飾パターンがよく耐容され、修飾siRNA分子が、ヒト腫瘍細胞を死滅させる強力な活性を保持していたことを証明するデータを例示する。
    修飾PLK1424 siRNAが、陰性対照より大きいIFN-α応答を誘導しなかったことを証明するデータを例示する。
    PLK1424 1/3 siRNA、PLK1424 2/3 siRNA、PLK1424 2/4 siRNA、およびPLK1424 2/6 siRNAにより、空SNALPのものを超える有意なIFIT1誘導が存在しなかったことを証明するデータを例示する。
    Hep3B腫瘍において試験された全てのPLK1424 siRNAがインビボで等価なレベルのPLK-1 mRNAサイレンシングを生じたことを証明するデータを例示する。]
    [0055] 発明の詳細な説明
    I.序論
    肝細胞癌（HCC）は、世界で5番めに多い固形腫瘍であり、4番目に多い癌による死因であり、毎年およそ400,000人の死亡の原因となっている（Thomas et al.,J.Clin.Oncol.,23:2892-2899(2005)）。HCCのためのいくつかの代替的な処置オプションが存在するが、現在、HCCのために有効な化学療法計画は存在せず、予後は極めて乏しいままである。外科的切除または完全肝臓移植が、根治の可能性のある唯一の治療と見なされている；しかしながら、HCC患者の70〜85％は、進行した腫瘍を呈し、しばしば、侵襲的な手術が禁忌である基礎肝疾患を患っている（Llovet et al.,J.Natl.Cancer Inst.,100:698-711(2008)）。最近、多重キナーゼ阻害剤ソラフェニブが、進行した疾患を有する患者の生存時間の改善（プラセボの7.9ヶ月に対して10.7ヶ月）を示す第III相データ（Llovet et al.,J.Hepatol.,48 Suppl 1:S20-37(2008)）に基づき、切除不能HCCの処置のため承認された。他の処置オプションが利用可能でないため、ソラフェニブは、この患者集団のためのケアの標準の一部になるであろう。肝臓は腫瘍転移性疾患の好発部位でもあり；例えば、結腸直腸癌患者のおよそ50％が、患者の死亡率の有意な増加をもたらす、肝臓への転移を発症する（Steele et al.,Annals Surgery,210:127-138(1989)）。全身投与された従来の化学療法薬およびターゲティングされた化学療法薬による組み合わせ治療は、これらの患者の生存時間を改善する；しかしながら、転移性結腸癌の非外科的治癒は未だ困難である。HCCおよび肝臓への転移性疾患は、より有効な処置オプションのための新規治療剤の開発を必要とする、重大な未解決の医学的必要性を表すことが、明らかである。]
    [0056] 低分子干渉RNAは、RNAiという内因性の細胞過程を通して遺伝子発現を抑制するために設計された強力な標的特異的分子である（Elbashir et al.,Nature,411:494-498(2001)）。この基本の遺伝子サイレンシング機序の特徴決定以来、広域の疾患のための可能性のある新規の治療剤のクラスとして、siRNAの開発は大きく進展した。しかしながら、siRNA治療薬の可能性の現実化に対する第一の障害は、siRNAの疾患部位へのターゲティングおよび細胞内送達を容易にする薬物送達媒体の必要性である（Zimmermann et al.,Nature,441:111-114(2006)；de Fougerolles et al.,Nat.Rev.Drug Discov.,6:443-453(2007)；Behlke,Mol.Ther.,13:644-670(2006)）。いくつかのグループは、siRNAの薬理学的特性を改善するために代替ヌクレオチド化学の使用を調査し（Soutschek et al.,Nature,432:173-178(2004)；Hall et al.,Nucleic AcidsRes.,32:5991-6000(2004)；Morrissey et al.,Hepatology,41:1349-1356(2005)）、他のグループは、ポリエチレンイミン（Urban-Klein et al.,Gene Ther.,12:461-466(2005)；Schiffelers et al.,Nucleic Acids Res.,32:e149(2004)）およびシクロデキストリンポリマー（Heidel et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,104:5715-5721(2007)）のようなポリカチオンとの複合体化により、または脂質に基づく担体への封入により（Zimmermann et al.（前記）；Morrissey et al.,Nat.Biotechnol.,23:1002-1007(2005)；Judge et al.,Mol.Ther.,13:494-505(2006)）、インビボsiRNA送達を改善した。特に興味深いのは、適当なサイズの電荷中性担体が、腫瘍のような臨床的な関心対象の部位において観察される有窓上皮を通過することができる、受動ターゲティングとも呼ばれる、「浸透および保持の増強（enhanced permeation and retention）」効果（Mayer et al.,Cancer Letters,53:183-190(1990)；Seymour,Crit.Rev.Ther.Drug Carrier Syst.,9:135-187(1992)）を利用することを目標とした戦略である。この効果を利用し、標的部位における有意な濃縮を達成するためには、担体は、小さく（100nm程度の直径）、長く循環血中に存在し、それにより、「初回通過」器官、肺、肝臓の毛細管床、および細網内皮系の食細胞を迂回することができなければならない。腫瘍標的部位におけるsiRNAの蓄積を濃縮するそのような系の利点は、ターゲティングされていない低分子薬物に比べて付加的な選択性を有する分子的治療薬を開発する可能性を提示する。]
    [0057] siRNAの多くの腫瘍学標的が文献に記載されているが、インビボの報告された治療効果がRNAiによって媒介されたものであるという直接の証拠は、顕著に欠けている。標的は、一般に以下の三つの広いカテゴリーへ分類される:（i）細胞周期または細胞分裂に関与しており、ダウンレギュレートされた時、直接、細胞障害性であるもの；（ii）増殖因子、それらの受容体、または血管形成因子のような、腫瘍細胞成長、腫瘍の進行または転移を支持するもの；および（iii）抗アポトーシスタンパク質、薬物耐性遺伝子、およびDNA修復酵素のような従来の治療アプローチに対する腫瘍の感受性を増加させるもの。本発明は、必須の細胞周期タンパク質ポロ様キナーゼ1（PLK-1）の発現を標的とすることに関する。]
    [0058] 細胞周期の進行は、サイクリン依存性キナーゼファミリーおよびポロ様キナーゼファミリーのもののようなキナーゼによって制御される。ポロ様キナーゼは、キイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）において最初に同定された、独特のホスホペプチド結合ポロボックスドメインを特徴とするセリン／トレオニンキナーゼであるポロにちなんで命名された（Barr et al.,Nat.Rev.Mol.Cell Biol.,5:429-440(2004)）。四つの哺乳動物PLKファミリーメンバー、PLK-1、PLK-2（Snkとしても公知）、PLK-3（PrkまたはFnkとしても公知）、およびPLK-4（Sakとしても公知）が、特徴決定されており、細胞周期の調節において非重複性の役割を有することが示されている（Barr et al.（前記））。全てが、予測される核移行シグナル（Taniguchi et al.,J.Biol.Chem.,277:48884-48888(2002)）を有しており、細胞周期の様々な段階に関与する核基質に対して協調して作用すると考えられている。哺乳動物細胞において、PLK-1は、Cdc25Cホスファターゼ、サイクリンB、有糸分裂紡錘体のコヒーシンサブユニット、後期促進複合体のサブユニット、哺乳動物キネシン様タンパク質1 MKLP-1、およびその他のキネシン関連タンパク質をリン酸化するよう作用する。この多様な基質の列挙は、有糸分裂および細胞質分裂におけるPLK-1の多数の役割を例示している（Barr et al.（前記））。多くのヒト腫瘍型において観察されるPLK-1の過剰発現は、患者の予後の負の予知因子であり（Strebhardt et al.,Nat.Rev.Cancer,6:321-330(2006)）、PLK-1活性の阻害は、有系分裂停止および腫瘍細胞アポトーシスを急速に誘導する（Steegmaier et al.,Curr.Biol.,17:316-322(2007)；Liu et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,100:5789-5794(2003））。PLK-1の枯渇は、低分子薬物のアポトーシス促進活性に対して癌細胞を感作するようにも作用する（Spankuch et al.,Oncogene,26:5793-5807(2007)）。これは、DNA傷害および紡錘体組み立てチェックポイントにおける機能的な役割による可能性が高い。これらの特色の組み合わせのため、PLK-1は、腫瘍学における治療的介入の興味深い標的である。]
    [0059] そのため、siRNAによるPLK-1のような癌関連遺伝子のターゲティングされたサイレンシングは、新規の治療戦略として非常に有望である。しかしながら、未修飾PLK-1 siRNA配列は、免疫刺激性であることがあり、例えば、自然免疫細胞からの強力な炎症応答を刺激することがあり、特に、細胞内取り込みを容易にする送達媒体と会合している場合、そうである。これは、炎症応答に関連した毒性および標的以外の遺伝子に対する作用のため、PLK-1siRNA分子の治療的開発にとって大きな障害となっている。本発明は、siRNAの一方の鎖または両方の鎖への2'-O-メチル（2'OMe）ウリジンヌクレオチドおよび／またはグアノシンヌクレオチドのような修飾ヌクレオチドの選択的な組み込みを使用して、PLK-1 siRNAに対する免疫応答を低下させるかまたは完全に抑止することにより、これらの限界を克服する。特に、siRNA二重鎖の二本鎖領域内への最小かつ選択的な2'OMe修飾の導入によって、PLK-1 siRNA配列の免疫刺激特性およびPLK-1発現をサイレンシングする能力を、釣り合わせるかまたは最適化することができる。これは、未修飾siRNAの使用に関連したサイトカイン誘導、毒性、および標的以外に対する効果なしに、治療的に実行可能なsiRNA用量で達成され得る。]
    [0060] 従って、本発明は、PLK-1発現をサイレンシングする化学的に修飾されたsiRNA分子およびその使用法を提供する。本発明は、本明細書に記載された修飾siRNA分子、カチオン性脂質、および非カチオン性脂質を含み、粒子の凝集を阻害する複合脂質をさらに含んでいてもよい、核酸-脂質粒子（例えば、SNALP）も提供する。本発明は、本明細書に記載された修飾siRNA分子を哺乳動物対象へ投与することにより、PLK-1遺伝子発現をサイレンシングする方法をさらに提供する。ある種の態様において、本発明は、HCCのような肝臓癌および肝臓転移性疾患の処置のための、ヒトPLK-1を標的とするsiRNA治療薬を提供する。本発明は、免疫刺激特性を有するPLK-1 siRNAを同定しかつ/または修飾する方法をさらに提供する。逐次、PLK-1 siRNAを送達し、その後、化学療法薬を送達することを含む、化学療法薬の効果に対して癌細胞のような細胞を感作する方法も、提供される。]
    [0061] 従って、本発明は、合理的に設計されたsiRNAが、安全かつ効率的な全身送達媒体を使用して送達された時、意図されない免疫刺激の非存在下で、確認されたRNAiの機序を通して、治療的なPLK-1遺伝子サイレンシングに影響を及ぼすことができることを証明する。]
    [0062] II.定義
    本明細書において使用されるように、以下の用語は、他に特記されない限り、それらに与えられている意味を有する。]
    [0063] 「ポロ様キナーゼ1」、「PLK-1」、「ポロ様キナーゼ」、または「PLK」という用語は、2個の機能ドメイン:（1）キナーゼドメイン；および（2）ポロボックスドメインを含有しているセリン／トレオニンキナーゼをさす（例えば、Barr et al.,Nat.Rev.Mol.Cell Biol.,5:429-440(2004)参照）。PLK-1の活性および細胞濃度は、細胞分裂の正確な調節のために重要である。PLK-1の発現および活性は、細胞周期のG0期、G1期、およびS期を通じて低いが、G2期に上昇し始め、M期にピークに達する。PLK-1は、有糸分裂および細胞分裂にとって必須であり、以下の過程に寄与する：中心体成熟、ならびにCdc25CおよびサイクリンB1のリン酸化による成熟促進因子の活性化；双極紡錘体形成；ならびにDNA傷害チェックポイント順応（DNA傷害は、G2および有糸分裂においてPLK-1を阻害する）。PLK-1は、有系分裂の中止および細胞質分裂のための後期促進複合体の成分の活性化にも関与している。PLK-1は、肝細胞腫および結腸癌を含む多くの癌型において過剰発現されており、PLK-1発現は、しばしば、乏しい患者の予後と相関する。PLK-1（野生型またはキナーゼ不活型）の過剰発現は、多重核生成（遺伝的不安定性）をもたらす。機能亢進性のPLK-1は、DNA傷害チェックポイントを無視する。構成性のPLK-1発現は、NIH 3T3細胞の形質転換を引き起こす。PLK-1は、p53腫瘍抑制因子をリン酸化し、それにより、p53のアポトーシス促進効果を阻害する。ヒトPLK-1mRNA配列は、Genbankアクセッション番号NM_005030、X73458、BC014846、BC003002、HSU01038、およびL19559に示されている。マウスPLK-1 mRNA配列は、Genbankアクセッション番号NM_011121に示されている。PLK-1は、セリン／トレオニンプロテインキナーゼ13（STPK13）としても公知である。]
    [0064] 「干渉RNA」または「RNAi」または「干渉RNA配列」という用語は、干渉RNAが標的遺伝子と同一の細胞内にある場合に、（即ち、干渉RNAの配列に相補的なmRNAの分解を媒介するかまたは翻訳を阻害することにより）標的遺伝子の発現を低下させるかまたは阻害することができる一本鎖RNA（例えば、成熟miRNA）または二本鎖RNA（即ち、siRNA、aiRNA、またはpre-miRNAのような二重鎖RNA）をさす。従って、干渉RNAとは、mRNA配列に相補的な一本鎖RNA、または2本の相補鎖もしくは単一の自己相補的な鎖により形成された二本鎖RNAをさす。干渉RNAは、標的遺伝子との実質的なもしくは完全な同一性を有していてもよいし、またはミスマッチ領域（即ち、ミスマッチモチーフ）を含んでいてもよい。干渉RNAの配列は、全長標的遺伝子に対応していてもよいし、またはその部分配列に対応していてもよい。]
    [0065] 干渉RNAには、「低分子干渉RNA」または「siRNA」、例えば、約15〜60、15〜50、または15〜40（二重鎖）ヌクレオチド長、より典型的には、約15〜30、15〜25、または19〜25（二重鎖）ヌクレオチド長の干渉RNAが含まれ、好ましくは、約20〜24、21〜22、または21〜23（二重鎖）ヌクレオチド長である（例えば、二本鎖siRNAの各相補配列は、15〜60、15〜50、15〜40、15〜30、15〜25、または19〜25ヌクレオチド長、好ましくは、約20〜24、21〜22、または21〜23ヌクレオチド長であり、二本鎖siRNAは、約15〜60、15〜50、15〜40、15〜30、15〜25、または19〜25塩基対長、好ましくは、約18〜22、19〜20、または19〜21塩基対長である）。siRNA二重鎖は、約1〜約4ヌクレオチド、または約2〜約3ヌクレオチドの3'突出、および5'リン酸末端を含んでいてもよい。siRNAの例には、非限定的に、一方の鎖がセンス鎖であり、他方が相補的なアンチセンス鎖である、2本の別々の分子より組み立てられた二本鎖ポリヌクレオチド分子；センス領域およびアンチセンス領域が、核酸に基づくリンカーまたは核酸に基づかないリンカーによって連結された、一本鎖分子から組み立てられた二本鎖ポリヌクレオチド分子；自己相補的なセンス領域およびアンチセンス領域を有するヘアピン二次構造を有する二本鎖ポリヌクレオチド分子；ならびに、インビボまたはインビトロでプロセシングされ、活性二本鎖siRNA分子を作製することができる、二つ以上のループ構造ならびに自己相補的なセンス領域およびアンチセンス領域を有するステムを含む環状一本鎖ポリヌクレオチド分子が含まれる。]
    [0066] 好ましくは、siRNAは化学合成される。siRNAは、大腸菌RNaseIIIまたはダイサーにより、より長いdsRNA（例えば、約25ヌクレオチド長より大きなdsRNA）の切断によって作製さてもよい。これらの酵素は、dsRNAを生物学的に活性のsiRNAへとプロセシングする（例えば、Yang et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,99:9942-9947(2002)；Calegari et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,99:14236(2002)；Byrom et al.,Ambion TechNotes,10(1):4-6(2003）；Kawasaki et al.,Nucleic Acids Res.,31:981-987(2003）；Knight et al.,Science,293:2269-2271(2001)；およびRobertson et al.,J.Biol.Chem.,243:82(1968)参照）。好ましくは、dsRNAは、少なくとも50ヌクレオチド〜約100、200、300、400、または500ヌクレオチド長である。dsRNAは、1000、1500、2000、5000ヌクレオチド長、またはそれ以上であってもよい。dsRNAは、遺伝子転写物全体をコードしてもよいし、または部分的な遺伝子転写物をコードしてもよい。ある種の例において、siRNAはプラスミドによってコードされてもよい（例えば、ヘアピンループを有する二重鎖へと自動的に折り畳まれる配列として転写されてもよい）。]
    [0067] 本明細書において使用されるように、「ミスマッチモチーフ」または「ミスマッチ領域」という用語は、その標的配列に対して100％の相補性を有していない、干渉RNA（例えば、siRNA、aiRNA、miRNA）配列の部分をさす。干渉RNAは、少なくとも1個、2個、3個、4個、5個、6個、またはそれ以上のミスマッチ領域を有していてもよい。ミスマッチ領域は、連続していてもよいし、または1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、もしくはよりそれ以上のヌクレオチドによって分離されていてもよい。ミスマッチモチーフまたはミスマッチ領域は、単一のヌクレオチドを含んでいてもよいし、または2個、3個、4個、5個、またはそれ以上のヌクレオチドを含んでいてもよい。]
    [0068] 干渉RNAの「有効量」または「治療的に有効な量」とは、所望の効果、例えば、干渉RNAの非存在下で検出される正常発現レベルと比較した標的配列の発現の阻害を生ずるために十分な量である。干渉RNAにより得られた値が、対照と比べて、約90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％、または0％である場合、標的遺伝子または標的配列の発現の阻害が達成されている。標的遺伝子または標的配列の発現を測定するための適当なアッセイには、例えば、ドットブロット、ノーザンブロット、インサイチューハイブリダイゼーション、ELISA、免疫沈降、酵素機能のような当業者に公知の技術を使用したタンパク質またはmRNAのレベルの調査のみならず、当業者に公知の表現型アッセイも含まれる。]
    [0069] 干渉RNAによる免疫応答を「減少させる」、「減少させること」、「低下させる」、または「低下させること」とは、所定の干渉RNA（例えば、修飾干渉RNA）に対する免疫応答の検出可能な減少を意味するものとする。修飾干渉RNAによる免疫応答の減少の量は、未修飾干渉RNAの存在下での免疫応答のレベルと比べて決定され得る。検出可能な減少とは、未修飾干渉RNAの存在下で検出される免疫応答より約5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、またはそれ以上、低いものであり得る。干渉RNAに対する免疫応答の減少は、典型的には、インビトロの応答細胞によるサイトカイン産生（例えば、IFNγ、IFNα、TNFα、IL-6、もしくはIL-12）の減少、または干渉RNAの投与後の哺乳動物対象の血清中のサイトカイン産生の減少により測定される。]
    [0070] 本明細書において使用されるように、「応答細胞」という用語は、未修飾siRNAのような免疫刺激性の干渉RNAと接触した時に、検出可能な免疫応答を生ずる細胞、好ましくは、哺乳動物細胞をさす。例示的な応答細胞には、例えば、樹状細胞、マクロファージ、末梢血単核細胞（PBMC）、脾細胞等が含まれる。検出可能な免疫応答には、例えば、TNF-α、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12、IL-13、TGF、およびそれらの組み合わせのような、サイトカインまたは増殖因子の産生が含まれる。]
    [0071] 「実質的同一性」とは、ストリンジェントな条件の下で参照配列にハイブリダイズする配列、または参照配列の指定された領域において指定された同一率を有する配列をさす。]
    [0072] 「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」という語句は、ある核酸が、標的配列、典型的には、複雑な核酸混合物の中の標的配列にハイブリダイズし、他の配列にはハイブリダイズしない条件をさす。ストリンジェントな条件は、配列依存性であり、異なる状況においては異なるであろう。より長い配列は、より高温で特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションに関する広範囲の案内は、Tijssen,Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Probes,"Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays"(1993)に見出される。一般に、ストリンジェントな条件は、明確なイオン強度pHでの特定の配列の融点（Tm）より約5〜10℃低く選択される。Tmとは、平衡時に、標的に相補的なプローブの50％が、標的配列にハイブリダイズする（明確なイオン強度、pH、および核酸濃度の下での）温度である（標的配列が過剰に存在するため、Tmにおいては、平衡時に、プローブの50％が占められる）。ストリンジェントな条件は、ホルムアミドのような不安定化剤の添加によっても達成され得る。選択的または特異的なハイブリダイゼーションのため、陽性シグナルは、バックグラウンドの少なくとも2倍、好ましくは、バックグラウンドハイブリダイゼーションの10倍である。]
    [0073] 例示的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、以下の通りであり得る：50％ホルムアミド、5×SSC、および1％SDS、42℃でのインキュベーション、または5×SSC、1％SDS、65℃でのインキュベーション、そして0.2×SSCおよび0.1％SDS、65℃での洗浄。PCRのため、約36℃の温度が、低ストリンジェンシー増幅のため典型的であるが、アニーリング温度は、プライマーの長さに依って、約32℃〜48℃の間で変動し得る。高ストリンジェンシーPCR増幅のためには、約62℃の温度が典型的であるが、高ストリンジェンシーアニーリング温度は、プラスミドの長さおよび特異性に依って、約50℃〜約65℃の範囲であり得る。高ストリンジェンシー増幅の場合にも、低ストリンジェンシー増幅の場合にも、典型的なサイクル条件には、90℃〜95℃30秒〜2分の変性期、30秒〜2分持続するアニーリング期、および約72℃1〜2分の伸長期が含まれる。低ストリンジェンシー増幅反応および高ストリンジェンシー増幅反応のためのプロトコルおよび指針は、例えば、Innis et al.(1990)PCR Protocols,A Guide to Methodsand Applications,Academic Press,Inc.N.Y.に提供されている。]
    [0074] ストリンジェントな条件の下で相互にハイブリダイズしない核酸であっても、それらがコードするポリペプチドが実質的に同一である場合には、やはり実質的に同一である。これは、例えば、遺伝暗号により許容される最大のコドン縮重を使用して、核酸のコピーが作出された場合に起こる。そのような場合、核酸は、典型的には、中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の下でハイブリダイズする。例示的な「中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」には、37℃での40％ホルムアミド、1M NaCl、1％SDSの緩衝液におけるハイブリダイゼーション、45℃での1×SSCにおける洗浄が含まれる。陽性ハイブリダイゼーションは、バックグラウンドの少なくとも2倍である。当業者は、代替的なハイブリダイゼーション条件および洗浄条件が、類似したストリンジェンシーの条件を提供するために利用され得ることを容易に認識するであろう。ハイブリダイゼーションパラメーターを決定するための付加的な指針は、多数の参照、例えば、Current Protocols in Molecular Biology,Ausubel et al.,eds.に提供されている。]
    [0075] 二つ以上の核酸に関する「実質的に同一の」または「実質的同一性」という用語は、以下の配列比較アルゴリズムのうちの一つを使用して、または手動アラインメントおよび目視検査により測定されるような、比較ウインドウまたは指定された領域における最大の一致のために比較され整列化された場合に、同一であるか、または指定された割合の同一ヌクレオチド（即ち、指定された領域における少なくとも約60％、好ましくは、少なくとも約65％、70％、75％、80％、85％、90％、または95％の同一性）を有する、二つ以上の配列または部分配列をさす。この定義は、前後関係が示す場合には、類似して配列の相補鎖もさす。好ましくは、実質的同一性は、少なくとも約5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、または60ヌクレオチド長である領域に存在する。]
    [0076] 配列比較のためには、典型的には、一つの配列を参照配列とし、テスト配列をそれと比較する。配列比較アルゴリズムを使用する場合には、テスト配列および参照配列をコンピューターへ入力し、必要であれば、サブシーケンス座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。デフォルトプログラムパラメータを使用してもよいし、または代替的なパラメータを指定してもよい。次いで、配列比較アルゴリズムが、プログラムパラメータに基づき、参照配列と比べたテスト配列の配列同一率を計算する。]
    [0077] 「比較ウインドウ」とは、本明細書において使用されるように、二つの配列が最適に整列化された後、ある配列が同数の連続位置の参照配列と比較され得る、約5〜約60、一般的には約10〜約45、より一般的には約15〜約30からなる群より選択される多数の連続位置のうちの一つのセグメントの参照を含む。比較のための配列の整列化の方法は、当技術分野において周知である。比較のための配列の最適の整列化は、例えば、Smith and Waterman,Adv.Appl.Math.,2:482(1981)のローカルホモロジーアルゴリズム、Needleman and Wunsch,J.Mol.Biol.,48:443(1970)のホモロジーアラインメントアルゴリズム、Pearson and Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85:2444(1988)の類似性検索法、これらのアルゴリズムのコンピューター化された実行（Wisconsin Genetics Software Package,Genetics Computer Group,575 Science Dr.,Madison,WIのGAP、BESTFIT、FASTA、およびTFASTA）、または手動アラインメントおよび目視検査（例えば、Current Protocols in Molecular Biology,Ausubel et al.,eds.（1995 supplement）参照）によって実施され得る。]
    [0078] 配列同一率および配列類似率を決定するのに適しているアルゴリズムの好ましい例は、それぞれ、Altschul et al.,Nuc.AcidsRes.,25:3389-3402(1977)およびAltschul et al.,J.Mol.Biol.,215:403-410(1990)に記載されているBLASTおよびBLAST 2.0アルゴリズムである。BLASTおよびBLAST 2.0は、本発明の核酸の配列同一率を決定するため、本明細書に記載されたパラメータと共に使用される。BLAST分析を実施するためのソフトウェアは、National Center for Biotechnology Information（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）を通して公に入手可能である。]
    [0079] BLASTアルゴリズムは、二つの配列の間の類似性の統計分析も実施する（例えば、Karlin and Altschul,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:5873-5787(1993)参照）。BLASTアルゴリズムにより提供される類似性の一つの尺度は、二つのヌクレオチド配列の間のマッチが偶然起こるであろう確率の指標を提供する、最小合計確率（smallest sum probability）（P(N)）である。例えば、テスト核酸の参照核酸との比較において、最小合計確率が約0.2未満、より好ましくは約0.01未満、最も好ましくは約0.001未満である場合、その核酸は、参照配列に類似していると見なされる。]
    [0080] 「核酸」という用語は、本明細書において使用されるように、一本鎖型または二本鎖型いずれかの少なくとも2個のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドを含有しているポリマーをさし、DNAおよびRNAを含む。DNAは、例えば、アンチセンス分子、プラスミドDNA、凝縮前DNA、PCR産物、ベクター（P1、PAC、BAC、YAC、人工染色体）、発現カセット、キメラ配列、染色体DNA、またはこれらの群の誘導体および組み合わせの形態であり得る。RNAは、siRNA、非対称干渉RNA（aiRNA）、マイクロRNA（miRNA）、mRNA、tRNA、rRNA、tRNA、vRNA、およびそれらの組み合わせの形態であり得る。核酸には、合成の、天然に存在する、天然には存在しない、公知のヌクレオチドアナログまたは修飾された骨格残基もしくは結合を含有しており、参照核酸と類似した結合特性を有する核酸が含まれる。そのようなアナログの例には、非限定的に、ホスホロチオエート、ホスホロアミデート、メチルホスホネート、キラル-メチルホスホネート、2'-O-メチルリボヌクレオチド、およびペプチド核酸（PNA）が含まれる。特に限定されない限り、その用語には、参照核酸と類似した結合特性を有する、天然ヌクレオチドの公知のアナログを含有している核酸が包含される。他に示されない限り、特定の核酸配列には、明示された配列のみならず、それらの保存的に修飾されたバリアント（例えば、縮重コドン置換）、対立遺伝子、オルソログ、SNP、および相補配列も暗示的に包含される。特に、縮重コドン置換は、一つまたは複数の選択された（または全ての）コドンの3番目の位置が、混合塩基および／またはデオキシイノシン残基に置換された配列を作製することにより達成され得る（Batzer et al.,Nucleic Acid Res.,19:5081(1991)；Ohtsuka et al.,J.Biol.Chem.,260:2605-2608(1985)；Rossolini et al.,Mol.Cell.Probes,8:91-98(1994)）。「ヌクレオチド」は、糖デオキシリボース（DNA）または糖リボース（RNA）、塩基、およびリン酸基を含有している。ヌクレオチドは、リン酸基を通して共に連結されている。「塩基」には、プリンおよびピリミジンが含まれ、これらには、さらに、天然化合物アデニン、チミン、グアニン、シトシン、ウラシル、イノシン、および天然アナログ、ならびにアミン、アルコール、チオール、カルボキシレート、およびハロゲン化アルキルのような新たな反応基を置く修飾を含むが、これらに限定はされない、プリンおよびピリミジンの合成誘導体が含まれる。]
    [0081] 「遺伝子」という用語は、ポリペプチドまたはポリペプチド前駆体の産生のために必要なコーディング配列の部分長または全長を含む核酸（例えば、DNAまたはRNA）配列をさす。]
    [0082] 「遺伝子産物」とは、本明細書において使用されるように、RNA転写物またはポリペプチドのような遺伝子の産物をさす。]
    [0083] 「脂質」という用語は、脂肪酸のエステルを含むが、これに限定はされず、水に不溶性であるが多くの有機溶媒には可溶性であることを特徴とする有機化合物の群をさす。それらは、一般的に、少なくとも三つのクラスへ分類される:（1）脂肪および油のみならず、ロウも含む「単純脂質」；（2）リン脂質および糖脂質を含む「複合脂質」；ならびに（3）ステロイドのような「誘導脂質」。]
    [0084] 「脂質小胞」とは、水性体積が両親媒性脂質二重層に封入されているリポソーム；または、干渉RNA配列を含むプラスミドのような大きい分子成分を含んでいる内部を、脂質が覆っており、低下した水性内部を有するリポソーム；または、封入された成分が比較的無秩序な脂質混合物内に含有されている脂質凝集物もしくはミセルを含むが、これらに限定はされない、干渉RNAのような化合物を送達するために使用され得る任意の脂質組成物をさす。脂質小胞という用語には、非限定的に、SPLP、pSPLP、SNALP、リポソーム、ミセル、ビロソーム、脂質-核酸複合体、およびそれらの混合物を含む、多様な脂質に基づく担体系のうちの任意のものが包含される。]
    [0085] 本明細書において使用されるように、「脂質に封入された」とは、核酸（例えば、干渉RNA）のような化合物に、完全な封入、部分的な封入、またはその両方を提供する脂質製剤をさすことができる。好ましい態様において、核酸は、（例えば、SPLP、pSPLP、SNALP、またはその他の核酸-脂質粒子が形成されるよう）脂質製剤に完全に封入される。]
    [0086] 本明細書において使用されるように、「SNALP」という用語は、安定な核酸-脂質粒子をさす。SNALPは、核酸（例えば、siRNA、aiRNA、miRNA、ssDNA、dsDNA、ssRNA、短いヘアピンRNA（shRNA）、dsRNA、または干渉RNAが転写されるプラスミドを含むプラスミド）が脂質に完全に封入されている、脂質（例えば、カチオン性脂質、非カチオン性脂質、および粒子の凝集を防止する複合脂質）より作製された粒子を表す。本明細書において使用されるように、「SNALP」という用語には、脂質に封入された核酸（例えば、プラスミド）を含む核酸-脂質粒子をさすために使用される用語であるSPLPが含まれる。SNALPおよびSPLPは、典型的には、カチオン性脂質、非カチオン性脂質、および脂質コンジュゲート（例えば、PEG-脂質コンジュゲート）を含有している。SNALPおよびSPLPは、静脈内（i.v.）注射後、延長された循環系寿命を示すことができ、遠位部位（例えば、投与部位から物理的に離れた部位）に蓄積し、これらの遠位部位において、トランスフェクトされた遺伝子の発現または標的遺伝子発現のサイレンシングを媒介することができるため、全身適用のために極めて有用である。SPLPには、PCT公開番号WO 00/03683に示されたような封入された縮合剤-核酸複合体を含む「pSPLP」が含まれる。]
    [0087] 本発明の核酸-脂質粒子は、典型的には、約50nm〜約150nm、より典型的には、約60nm〜約130nm、より典型的には、約70nm〜約110nm、最も典型的には、約70〜約90nmの平均直径を有し、かつ実質的に非毒性である。さらに、核酸は、本発明の核酸-脂質粒子中に存在する場合、水性溶液中でヌクレアーゼによる分解に対して抵抗性である。核酸-脂質粒子およびそれらの調製法は、例えば、米国特許公開第20040142025号および米国特許公開第20070042031号に開示されている。]
    [0088] 「脂質製剤」または「脂質に基づく製剤」とは、干渉RNAのような核酸を関心対象の標的部位へ送達するために使用され得るSNALPをさすために本明細書において使用される。カチオン性脂質、非カチオン性脂質、および脂質コンジュゲートから典型的に形成される脂質製剤において、核酸は脂質に封入され、それにより、核酸はヌクレアーゼ分解から保護される。]
    [0089] 「脂質コンジュゲート」という用語は、核酸-脂質粒子の凝集を阻害する複合脂質をさす。そのような脂質コンジュゲートには、ポリアミドオリゴマー（例えば、ATTA-脂質コンジュゲート）、ジアルキルオキシプロピルにカップリングされたPEG、ジアシルグリセロールにカップリングされたPEG、コレステロールにカップリングされたPEG、ホスファチジルエタノールアミンにカップリングされたPEG、セラミドにコンジュゲートされたPEG（例えば、米国特許第5,885,613号参照）、カチオン性PEG脂質、およびそれらの混合物のようなPEG-脂質コンジュゲートが含まれるが、これらに限定はされない。PEGは、脂質に直接コンジュゲートされてもよいし、またはリンカーモエティを介して脂質に連結されてもよい。例えば、非エステル含有リンカーモエティおよびエステル含有リンカーモエティを含む、脂質にPEGをカップリングするのに適している任意のリンカーモエティが使用され得る。好ましい態様において、非エステル含有リンカーモエティが使用される。]
    [0090] 「両親媒性脂質」という用語は、脂質材料の疎水性部分が疎水相の方を向き、親水性部分が水相の方を向いている適当な材料を一部さす。親水性特徴は、炭水化物、リン酸基、カルボキシル基、スルファト基、アミノ基、スルフヒドリル基、ニトロ基、ヒドロキシル基等のような、極性基または電荷を有する基の存在に由来する。疎水性は、飽和および不飽和の長鎖脂肪族炭化水素基、および一つまたは複数の芳香族基、脂環式基、または複素環式基により置換されたそのような基を含むが、これらに限定はされない、無極性基の内含により付与され得る。両親媒性化合物の例には、リン脂質、アミノ脂質、およびスフィンゴ脂質が含まれるが、これらに限定はされない。]
    [0091] リン脂質の代表例には、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン、リゾホスファチジルコリン、リゾホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン、およびジリノレオイルホスファチジルコリンが含まれるが、これらに限定はされない。スフィンゴ脂質、糖スフィンゴ脂質ファミリー、ジアシルグリセロール、およびβ-アシルオキシ酸のようなリンを欠くその他の化合物も、両親媒性脂質と呼ばれる群に含まれる。さらに、上記の両親媒性脂質は、トリグリセリドおよびステロールを含むその他の脂質と混合されてもよい。]
    [0092] 「中性脂質」という用語は、選択されたpHにおいて、電荷を有していないかまたは中性の双性の型で存在する多数の脂質種のうちの任意のものをさす。生理的pHにおいて、そのような脂質には、例えば、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、セファリン、コレステロール、セレブロシド、およびジアシルグリセロールが含まれる。]
    [0093] 「非カチオン性脂質」という用語は、両親媒性脂質のみならず、その他の中性脂質またはアニオン性脂質もさす。]
    [0094] 「アニオン性脂質」という用語は、生理的pHで、負の電荷を有する任意の脂質をさす。これらの脂質には、ホスファチジルグリセロール、カルジオリピン、ジアシルホスファチジルセリン、ジアシルホスファチジン酸、N-ドデカノイルホスファチジルエタノールアミン、N-スクシニルホスファチジルエタノールアミン、N-グルタリルホスファチジルエタノールアミン、リジルホスファチジルグリセロール、パルミトイルオレイオルホスファチジルグリセロール（POPG）、および中性脂質に接合されたその他のアニオン性修飾基が含まれるが、これらに限定はされない。]
    [0095] 「カチオン性脂質」という用語は、生理的pH（例えば、約7.0のpH）のような選択されたpHで、正味の正の電荷を保持している多数の脂質種のうちの任意のものをさす。驚くべきことに、複数の不飽和部位、例えば、少なくとも2個または3個の不飽和部位を有するアルキル鎖を含むカチオン性脂質は、増加した膜流動性を有する核酸-脂質粒子を形成するために特に有用であることが見出されている。本発明においても有用である多数のカチオン性脂質および関連アナログが、米国特許公開第20060083780号よび第20060240554号；米国特許第5,208,036号；第5,264,618号；第5,279,833号；第5,283,185号；第5,753,613号；および第5,785,992号；ならびにPCT公開WO 96/10390に記載されている。カチオン性脂質の例には、1,2-ジリノレイルオキシ-N,N-ジメチルアミノプロパン（DLinDMA）、1,2-ジリノレニルオキシ-N,N-ジメチルアミノプロパン（DLenDMA）、N,N-ジオレイル-N,N-ジメチルアンモニウムクロリド（DODAC）、ジオクタデシルジメチルアンモニウム（DODMA）、ジステアリルジメチルアンモニウム（DSDMA）、N-(1-(2,3-ジオレイルオキシ)プロピル)-N,N,N-トリメチルアンモニウムクロリド（DOTMA）、N,N-ジステアリル-N,N-ジメチルアンモニウムブロミド（DDAB）、N-(1-(2,3-ジオレイルオキシ)プロピル)-N,N,N-トリメチルアンモニウムクロリド（DOTAP）、3-(N-(N',N'-ジメチルアミノエタン)-カルバモイル)コレステロール（DC-Chol）、N-(1,2-ジミリスチルオキシプロパ-3-イル)-N,N-ジメチル-N-ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（DMRIE）、2,3-ジオレイルオキシ-N-[2(スペルミン-カルボキサミド)エチル]-N,N-ジメチル-1-プロパンアミニウムトリフルオロアセテート（DOSPA）、ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン(DOGS）、3-ジメチルアミノ-2-(コレスタ-5-エン-3-ベータ-オキシブタン-4-オキシ)-1-(cis,cis-9,12-オクタデカジエンオキシ)プロパン（CLinDMA）、2-[5'-(コレスタ-5-エン-3.ベータ.-オキシ)-3'-オキサペントキシ)-3-ジメチル-1-(cis,cis-9',1-2'-オクタデカジエンオキシ)プロパン（CpLinDMA）、N,N-ジメチル-3,4-ジオレイルオキシベンジルアミン（DMOBA）、1,2-N,N'-ジオレイルカルバミル-3-ジメチルアミノプロパン（DOcarbDAP）、2,3-ジリノレオイルオキシ-N,N-ジメチルプロピルアミン（DLinDAP）、1,2-N,N'-ジリノレイルカルバミル-3-ジメチルアミノプロパン（DLincarbDAP）、1,2-ジリノレオイルカルバミル-3-ジメチルアミノプロパン（DLinCDAP）、2,2-ジリノレイル-4-ジメチルアミノメチル-[1,3]-ジオキソラン（DLin-K-DMA）、2,2-ジリノレイル-4-ジメチルアミノエチル-[1,3]-ジオキソラン（DLin-K-XTC2-DMA）、およびそれらの混合物が含まれるが、これらに限定はされない。いくつかの場合、カチオン性脂質は、プロトン化可能な三級アミン頭部、C18アルキル鎖、頭部とアルキル鎖との間のエーテル結合、および0〜3個の二重結合を含む。そのような脂質には、例えば、DSDMA、DLinDMA、DLenDMA、およびDODMAが含まれる。カチオン性脂質は、エーテル結合およびpH滴定可能な頭部を含んでいてもよい。そのような脂質には、例えば、DODMAが含まれる。]
    [0096] 「疎水性脂質」という用語は、飽和および不飽和の長鎖脂肪族炭化水素基、ならびに1個または複数個の芳香族基、脂環式基、または複素環式基によって置換されていてもよいそのような基を含むが、これらに限定はされない、無極性基を有する化合物をさす。適当な例には、ジアシルグリセロール、ジアルキルグリセロール、N-N-ジアルキルアミノ、1,2-ジアシルオキシ-3-アミノプロパン、および1,2-ジアルキル-3-アミノプロパンが含まれるが、これらに限定はされない。]
    [0097] 「融合性の」という用語は、リポソーム、SNALP、またはその他の薬物送達系の、細胞の膜と融合する能力をさす。膜は、原形質膜であってもよいし、または細胞器官、例えば、エンドソーム、核等を囲む膜であってもよい。]
    [0098] 本明細書において使用されるように、「水性溶液」という用語は、完全にまたは部分的に水を含む組成物をさす。]
    [0099] 本明細書において使用されるように、「有機脂質溶液」という用語は、完全にまたは部分的に、脂質を有する有機溶媒を含む組成物をさす。]
    [0100] 「遠位部位」とは、本明細書において使用されるように、隣接した毛細血管床に限定されず、生物の全身に広く分布する部位を含む、物理的に離れた部位をさす。]
    [0101] 核酸-脂質粒子に関して「血清安定」とは、遊離のDNAまたはRNAを有意に分解するであろう血清への曝露またはヌクレアーゼアッセイの後に、粒子が有意に分解されないことを意味する。適当なアッセイには、例えば、標準的な血清アッセイ、DNAseアッセイ、またはRNAseアッセイが含まれる。]
    [0102] 「全身送達」とは、本明細書において使用されるように、生物において干渉RNAのような化合物の広い体内分布をもたらす送達をさす。ある種の化合物の全身送達をもたらし得る投与技術もあるし、そうでないものもある。全身送達とは、有用な、好ましくは、治療的な量の化合物が、身体各部の大部分に曝されることを意味する。広い体内分布を入手するためには、一般に、化合物が、投与部位に対して遠位の疾患部位に到達する前に、（例えば、初回通過器官（肝臓、肺等）により、または迅速な非特異的な細胞結合により）急速に分解されるかまたは除去されることがないような血中寿命が必要とされる。核酸-脂質粒子の全身送達は、例えば、静脈内、皮下、および腹腔内を含む、当技術分野において公知の任意の手段によることができる。好ましい態様において、核酸-脂質粒子の全身送達は静脈内送達による。]
    [0103] 「局所送達」とは、本明細書において使用されるように、干渉RNAのような化合物の、生物体内の標的部位への直接の送達をさす。例えば、化合物は、腫瘍のような疾患部位、または炎症部位のようなその他の標的部位、または肝臓、心臓、膵臓、腎臓等のような標的器官へ、直接注射により局所送達され得る。]
    [0104] 「哺乳動物」という用語は、ヒト、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ハムスター、モルモット、ウサギ、家畜等のような任意の哺乳動物種をさす。]
    [0105] 「癌」という用語は、異常細胞の無制御の成長を特徴とする疾患クラスの任意のメンバーをさす。その用語には、悪性、良性、軟部組織、または固形のいずれを特徴とするかに関わらず、全ての公知の癌および新生物状態が含まれ、転移前癌および転移後癌を含む全ての病期およびグレードの癌が含まれる。種々の型の癌の例には、肝臓癌、肺癌、結腸癌、直腸癌、肛門癌、胆管癌、小腸癌、胃癌（胃の癌）、食道癌；胆嚢癌、膵臓癌、虫垂癌、乳癌、卵巣癌；子宮頸癌、前立腺癌、腎臓癌（例えば、腎細胞癌）、中枢神経系の癌、神経膠芽腫、皮膚癌、リンパ腫、絨毛癌、頭頸部癌、骨原性肉種、および血液癌が含まれるが、これらに限定はされない。肝臓癌の特定の型の非限定的な例には、肝細胞癌、（他の何らかの非肝臓癌細胞型の転移により引き起こされた）二次性肝臓癌、および肝芽腫が含まれる。本明細書において使用されるように、「腫瘍」には、1個または複数個の癌細胞が含まれる。]
    [0106] III.態様の説明
    本発明は、PLK-1発現を標的とする干渉RNA（例えば、siRNA、aiRNA、miRNA等）を含む組成物、およびPLK-1発現をサイレンシングするためのそのような組成物の使用法を提供する。]
    [0107] 一つの局面において、本発明は、PLK-1発現をサイレンシングすることができる、約15〜約60ヌクレオチド長の二本鎖領域を含む修飾siRNA分子を提供し、ここで二本鎖領域内のヌクレオチドのうちの1個または複数個は修飾ヌクレオチドを含む。]
    [0108] 一つの態様において、修飾siRNA分子は、2'-O-メチル（2'OMe）ヌクレオチド、2'-デオキシ-2'-フルオロ（2'F）ヌクレオチド、2'-デオキシヌクレオチド、2'-O-(2-メトキシエチル)（MOE）ヌクレオチド、ロックド核酸（LNA）ヌクレオチド、およびそれらの混合物からなる群より選択される修飾ヌクレオチドを含む。好ましい態様において、修飾siRNA分子は2'OMeヌクレオチドを含む。非限定的な例として、2'OMeヌクレオチドは、2'OMe-グアノシンヌクレオチド、2'OMe-ウリジンヌクレオチド、およびそれらの混合物からなる群より選択され得る。]
    [0109] もう一つの態様において、修飾siRNA分子は、約15〜約30ヌクレオチド長の二本鎖領域を含む。ある種の例において、修飾siRNA分子は、修飾siRNA分子の一方の鎖に修飾ヌクレオチドを含む。ある種の他の例において、修飾siRNA分子は、修飾siRNA分子の両方の鎖に修飾ヌクレオチドを含む。典型的には、二本鎖領域内のヌクレオチドのうちの2個、3個、4個、5個、6個、7個、またはそれ以上が、修飾ヌクレオチドを含む。]
    [0110] ある種の態様において、二本鎖領域内のヌクレオチドのうちの約25％未満が修飾ヌクレオチドを含む。他の態様において、二本鎖領域内のヌクレオチドのうちの約20％未満が修飾ヌクレオチドを含む。さらに他の態様において、二本鎖領域内のヌクレオチドのうちの約15％未満が修飾ヌクレオチドを含む。付加的な態様において、二本鎖領域内のヌクレオチドのうちの約10％〜約20％が修飾ヌクレオチドを含む。]
    [0111] さらなる態様において、修飾siRNA分子は、対応する未修飾siRNA配列より低免疫刺激性である。そのような態様において、低下した免疫刺激特性を有する修飾siRNA分子は、有利なことに、標的PLK-1配列に対するRNAi活性を保持している。もう一つの態様において、siRNA配列への、例えば、siRNA二重鎖の二本鎖領域内への最小かつ選択的な2'OMe修飾の導入によって、本明細書に記載された修飾siRNA分子の免疫刺激特性およびPLK-1発現をサイレンシングする能力を釣り合わせるかまたは最適化することができる。]
    [0112] ある種の例において、修飾siRNA分子は、対応する未修飾siRNA配列より少なくとも約70％低免疫刺激性である。ある種の他の例において、修飾siRNA分子は、対応する未修飾siRNA配列のものの10倍以下であるIC50を有する。]
    [0113] いくつかの例において、修飾siRNA分子は、修飾siRNA分子の一方の鎖に3'突出を含む。他の例において、修飾siRNA分子は、修飾siRNA分子の両方の鎖に3'突出を含む。いくつかの例において、修飾siRNA分子は、ヘアピンループ構造を含む。]
    [0114] 修飾siRNA分子は、典型的には、siRNA分子の二本鎖領域内に1個もしくは複数個の修飾ヌクレオチドを有する、センス鎖、アンチセンス鎖、またはセンス鎖およびアンチセンス鎖を含む。]
    [0115] ある種の態様において、修飾siRNA分子のセンス鎖は、表1に示されたセンス鎖配列のうちの一つを含むかまたはからなる。一つの好ましい態様において、センス鎖は、SEQID NO:1の核酸配列を含むかまたはからなる。もう一つの好ましい態様において、センス鎖は、SEQ ID NO:3の核酸配列を含むかまたはからなる。ある種の他の態様において、修飾siRNA分子のアンチセンス鎖は、表1に示されたアンチセンス鎖配列のうちの一つを含むかまたはからなる。一つの好ましい態様において、アンチセンス鎖は、SEQ ID NO:2の核酸配列を含むかまたはからなる。もう一つの好ましい態様において、アンチセンス鎖は、SEQ ID NO:4の核酸配列を含むかまたはからなる。本明細書に記載されるように、表1に示されたセンス鎖配列および／またはアンチセンス鎖配列のヌクレオチドのうちの1個または複数個は、siRNA分子の二本鎖領域内に位置する修飾ヌクレオチドを含んでいてもよい。いくつかの例において、センス鎖および／またはアンチセンス鎖は、「dTdT」または「UU」3'突出を含有する。他の例において、センス鎖および／またはアンチセンス鎖は、標的配列またはその相補鎖に対する相補性を有する3'突出を含有する。さらなる例において、センス鎖、アンチセンス鎖、または両方の鎖の3'突出は、本明細書に記載されたもののような修飾ヌクレオチド（例えば、2'OMeヌクレオチド）を1個、2個、3個、4個、またはそれ以上含む。]
    [0116] いくつかの態様において、修飾siRNA分子のセンス鎖は、表2に示されたセンス鎖配列のうちの一つを含むかまたはからなる。他の態様において、修飾siRNA分子のアンチセンス鎖は、表2に示されたアンチセンス鎖配列のうちの一つを含むかまたはからなる。本明細書に記載されるように、表2に示されたセンス鎖配列および／またはアンチセンス鎖配列のヌクレオチドのうちの1個または複数個は、siRNA分子の二本鎖領域内に位置する修飾ヌクレオチドを含んでいてもよい。いくつかの例において、センス鎖および／またはアンチセンス鎖は、「dTdT」または「UU」3'突出を含有する。他の例において、センス鎖および／またはアンチセンス鎖は、標的配列またはその相補鎖に対する相補性を有する3'突出を含有する。さらなる例において、センス鎖、アンチセンス鎖、または両方の鎖の3'突出は、本明細書に記載されたもののような修飾ヌクレオチド（例えば、2'OMeヌクレオチド）を1個、2個、3個、4個、またはそれ以上含む。]
    [0117] ある種の態様において、修飾siRNA分子のセンス鎖は、表3に示された未修飾センス鎖配列のうちの一つを含むかまたはからなる。一つの好ましい態様において、センス鎖は、SEQID NO:51の核酸配列を含むかまたはからなる。もう一つの好ましい態様において、センス鎖は、SEQ ID NO:58の核酸配列を含むかまたはからなる。さらにもう一つの好ましい態様において、センス鎖は、SEQ ID NO:65の核酸配列を含むかまたはからなる。ある種の他の態様において、修飾siRNA分子のアンチセンス鎖は、表3に示された未修飾アンチセンス鎖配列のうちの一つを含むかまたはからなる。一つの好ましい態様において、アンチセンス鎖は、SEQ ID NO:52の核酸配列を含むかまたはからなる。もう一つの好ましい態様において、アンチセンス鎖は、SEQ ID NO:59の核酸配列を含むかまたはからなる。さらにもう一つの好ましい態様において、アンチセンス鎖は、SEQ ID NO:66の核酸配列を含むかまたはからなる。本明細書に記載されるように、表3に示された未修飾のセンス鎖配列および／またはアンチセンス鎖配列のヌクレオチドのうちの1個または複数個は、siRNA分子の二本鎖領域内に位置する修飾ヌクレオチドを含んでいてもよい。いくつかの例において、センス鎖および／またはアンチセンス鎖は、「dTdT」または「UU」3'突出を含有する。他の例において、センス鎖および／またはアンチセンス鎖は、標的配列またはその相補鎖に対する相補性を有する3'突出を含有する。さらなる例において、センス鎖、アンチセンス鎖、または両方の鎖の3'突出は、本明細書に記載されたもののような修飾ヌクレオチド（例えば、2'OMeヌクレオチド）を1個、2個、3個、4個、またはそれ以上含む。]
    [0118] いくつかの態様において、修飾siRNA分子のセンス鎖は、表3に示された修飾センス鎖配列のうちの一つを含むかまたはからなる。一つの好ましい態様において、センス鎖は、SEQID NO:57の核酸配列を含むかまたはからなる。もう一つの好ましい態様において、センス鎖は、SEQ ID NO:64の核酸配列を含むかまたはからなる。さらにもう一つの好ましい態様において、センス鎖は、SEQ ID NO:67の核酸配列を含むかまたはからなる。いくつかの例において、センス鎖は、「dTdT」または「UU」3'突出を含有する。他の例において、センス鎖は、標的配列の相補鎖に対する相補性を有する3'突出を含有する。さらなる例において、センス鎖の3'突出は、本明細書に記載されたもののような修飾ヌクレオチド（例えば、2'OMeヌクレオチド）を1個、2個、3個、4個、またはそれ以上含む。]
    [0119] 他の態様において、修飾siRNA分子のアンチセンス鎖は、表3に示された修飾アンチセンス鎖配列のうちの一つを含むかまたはからなる。一つの好ましい態様において、アンチセンス鎖は、SEQID NO:54の核酸配列を含むかまたはからなる。もう一つの好ましい態様において、アンチセンス鎖は、SEQ ID NO:56の核酸配列を含むかまたはからなる。さらにもう一つの好ましい態様において、アンチセンス鎖は、SEQ ID NO:63の核酸配列を含むかまたはからなる。付加的な好ましい態様において、アンチセンス鎖は、SEQ ID NO:68の核酸配列を含むかまたはからなる。いくつかの例において、アンチセンス鎖は、「dTdT」または「UU」3'突出を含有する。他の例において、アンチセンス鎖は、標的配列に対する相補性を有する3'突出を含有する。さらなる例において、アンチセンス鎖の3'突出は、本明細書に記載されたもののような修飾ヌクレオチド（例えば、2'OMeヌクレオチド）を1個、2個、3個、4個、またはそれ以上含む。]
    [0120] いくつかの態様において、修飾siRNA分子のセンス鎖は、表4〜5に示されたセンス鎖配列のうちの一つを含むかまたはからなる。ある種の他の態様において、修飾siRNA分子のアンチセンス鎖は、表4〜5に示されたアンチセンス鎖配列のうちの一つを含むかまたはからなる。本明細書に記載されるように、表4〜5に示されたセンス鎖配列および／またはアンチセンス鎖配列のヌクレオチドのうちの1個または複数個は、siRNA分子の二本鎖領域内に位置する修飾ヌクレオチドを含んでいてもよい。いくつかの例において、センス鎖および／またはアンチセンス鎖は、「dTdT」または「UU」3'突出を含有する。他の例において、センス鎖および／またはアンチセンス鎖は、標的配列またはその相補鎖に対する相補性を有する3'突出を含有する。さらなる例において、センス鎖、アンチセンス鎖、または両方の鎖の3'突出は、本明細書に記載されたもののような修飾ヌクレオチド（例えば、2'OMeヌクレオチド）を1個、2個、3個、4個、またはそれ以上含む。]
    [0121] ある種の態様において、修飾siRNA分子のセンス鎖は、表6に示された未修飾センス鎖配列のうちの一つを含むかまたはからなる。一つの好ましい態様において、センス鎖は、SEQID NO:211の核酸配列を含むかまたはからなる。もう一つの好ましい態様において、センス鎖は、SEQ ID NO:218の核酸配列を含むかまたはからなる。ある種の他の態様において、修飾siRNA分子のアンチセンス鎖は、表6に示された未修飾アンチセンス鎖配列のうちの一つを含むかまたはからなる。一つの好ましい態様において、アンチセンス鎖は、SEQ ID NO:212の核酸配列を含むかまたはからなる。もう一つの好ましい態様において、アンチセンス鎖は、SEQ ID NO:219の核酸配列を含むかまたはからなる。本明細書に記載されるように、表6に示された未修飾のセンス鎖配列および／またはアンチセンス鎖配列のヌクレオチドのうちの1個または複数個は、siRNA分子の二本鎖領域内に位置する修飾ヌクレオチドを含んでいてもよい。いくつかの例において、センス鎖および／またはアンチセンス鎖の「UU」3'突出のウリジンヌクレオチドの一方または両方は、本明細書に記載されたもののような修飾ヌクレオチド（例えば、2'OMe-ウリジンヌクレオチド）を含む。]
    [0122] いくつかの態様において、修飾siRNA分子のセンス鎖は、表6に示された修飾センス鎖配列のうちの一つを含むかまたはからなる。一つの好ましい態様において、センス鎖は、SEQID NO:214の核酸配列を含むかまたはからなる。もう一つの好ましい態様において、センス鎖は、SEQ ID NO:220の核酸配列を含むかまたはからなる。いくつかの例において、センス鎖の「UU」3'突出のウリジンヌクレオチドの一方または両方は、本明細書に記載されたもののような修飾ヌクレオチド（例えば、2'OMe-ウリジンヌクレオチド）を含む。]
    [0123] 他の態様において、修飾siRNA分子のアンチセンス鎖は、表6に示された修飾アンチセンス鎖配列のうちの一つを含むかまたはからなる。一つの好ましい態様において、アンチセンス鎖は、SEQID NO:215の核酸配列を含むかまたはからなる。もう一つの好ましい態様において、アンチセンス鎖は、SEQ ID NO:216の核酸配列を含むかまたはからなる。さらにもう一つの好ましい態様において、アンチセンス鎖は、SEQ ID NO:223の核酸配列を含むかまたはからなる。いくつかの例において、アンチセンス鎖の「UU」3'突出のウリジンヌクレオチドの一方または両方は、本明細書に記載されたもののような修飾ヌクレオチド（例えば、2'OMe-ウリジンヌクレオチド）を含む。]
    [0124] いくつかの態様において、修飾siRNA分子のセンス鎖は、表7に示されたセンス鎖配列のうちの一つを含むかまたはからなる。他の態様において、修飾siRNA分子のアンチセンス鎖は、表7に示されたセンス鎖配列のうちの一つに相補的な配列を含むかまたはからなる（「UU」3'突出を除く）。本明細書に記載されるように、表7に示されたセンス鎖配列および／または相補的なアンチセンス鎖配列のヌクレオチドのうちの1個または複数個は、siRNA分子の二本鎖領域内に位置する修飾ヌクレオチドを含んでいてもよい。いくつかの例において、センス鎖および／またはアンチセンス鎖の「UU」3'突出のウリジンヌクレオチドの一方または両方は、本明細書に記載されたもののような修飾ヌクレオチド（例えば、2'OMe-ウリジンヌクレオチド）を含む。]
    [0125] いくつかの態様において、修飾siRNA分子のセンス鎖は、表10に示された修飾されたセンス鎖配列のうちの一つを含むかまたはからなる。一つの好ましい態様において、センス鎖は、SEQID NO:400の核酸配列を含むかまたはからなる。他の態様において、修飾siRNA分子のアンチセンス鎖は、表10に示された修飾アンチセンス鎖配列のうちの一つを含むかまたはからなる。一つの好ましい態様において、アンチセンス鎖は、SEQ ID NO:403の核酸配列を含むかまたはからなる。いくつかの例において、センス鎖および／またはアンチセンス鎖の3'突出のヌクレオチドの一方または両方は、本明細書に記載されたもののような修飾ヌクレオチド（例えば、2'OMe-ウリジンヌクレオチド）を含む。]
    [0126] ある種の態様において、修飾siRNA分子は、表11に示されたsiRNA分子のうちの一つまたは複数からなる群より選択される。好ましい態様において、修飾siRNA分子はPLK1424 2/6である。]
    [0127] ある種の他の態様において、修飾siRNA分子は、PLK1424 2/6、PLK1424 U4/GU、PLK1424 U4/G、PLK773 G/GU、PLK1425 3/5、およびそれらの混合物からなる群より選択される。]
    [0128] もう一つの態様において、修飾siRNA分子は、担体系をさらに含む。ある種の例において、担体系は、核酸-脂質粒子、リポソーム、ミセル、ビロソーム、核酸複合体、およびそれらの混合物からなる群より選択される。一般に、核酸複合体は、カチオン性脂質、カチオン性ポリマー、シクロデキストリン、またはそれらの混合物と複合体化された修飾siRNA分子を含み得る。非限定的な例として、修飾siRNA分子は、ポリエチレンイミン（PEI）であるカチオン性ポリマーと複合体化され得る。好ましい態様において、単体系は核酸-脂質粒子である。]
    [0129] 他の態様において、本発明は、本明細書に記載された修飾siRNA分子と薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物を提供する。]
    [0130] もう一つの局面において、本発明は、本明細書に記載された修飾siRNA分子と、カチオン性脂質と、非カチオン性脂質とを含む核酸-脂質粒子を提供する。]
    [0131] いくつかの態様において、カチオン性脂質は、1,2-ジリノレイルオキシ-N,N-ジメチルアミノプロパン（DLinDMA）、1,2-ジリノレニルオキシ-N,N-ジメチルアミノプロパン（DLenDMA）、N,N-ジオレイル-N,N-ジメチルアンモニウムクロリド（DODAC）、N,N-ジステアリル-N,N-ジメチルアンモニウムブロミド（DDAB）、N-(1-(2,3-ジオレイルオキシ)プロピル)-N,N,N-トリメチルアンモニウムクロリド（DOTAP）、ジステアリルジメチルアンモニウム（DSDMA）、N-(1-(2,3-ジオレイルオキシ)プロピル)-N,N,N-トリメチルアンモニウムクロリド（DOTMA）、N,N-ジメチル-2,3-ジオレイルオキシプロピルアミン（DODMA）、3-(N-(N',N'-ジメチルアミノエタン)-カルバモイル)コレステロール（DC-Chol）、N-(1,2-ジミリスチルオキシプロパ-3-イル)-N,N-ジメチル-N-ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（DMRIE）、2,3-ジオレイルオキシ-N-[2(スペルミン-カルボキサミド)エチル]-N,N-ジメチル-1-プロパンアミニウムトリフルオロアセテート（DOSPA）、ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン(DOGS）、3-ジメチルアミノ-2-(コレスタ-5-エン-3-ベータ-オキシブタン-4-オキシ)-1-(cis,cis-9,12-オクタデカジエンオキシ)プロパン（CLinDMA）、2-[5'-(コレスタ-5-エン-3-ベータ-オキシ)-3'-オキサペントキシ)-3-ジメチル-1-(cis,cis-9',1-2'-オクタデカジエンオキシ)プロパン（CpLinDMA）、N,N-ジメチル-3,4-ジオレイルオキシベンジルアミン（DMOBA）、1,2-N,N'-ジオレイルカルバミル-3-ジメチルアミノプロパン（DOcarbDAP）、2,3-ジリノレオイルオキシ-N,N-ジメチルプロピルアミン（DLinDAP）、1,2-N,N'-ジリノレイルカルバミル-3-ジメチルアミノプロパン（DLincarbDAP）、1,2-ジリノレオイルカルバミル-3-ジメチルアミノプロパン（DLinCDAP）、2,2-ジリノレイル-4-ジメチルアミノメチル-[1,3]-ジオキソラン（DLin-K-DMA）、2,2-ジリノレイル-4-ジメチルアミノエチル-[1,3]-ジオキソラン（DLin-K-XTC2-DMA）、およびそれらの混合物からなる群より選択されるメンバーである。好ましい態様において、カチオン性脂質はDLinDMAである。]
    [0132] ある種の態様において、非カチオン性脂質はアニオン性脂質である。ある種の他の態様において、非カチオン性脂質は中性脂質である。]
    [0133] いくつかの態様において、非カチオン性脂質は、ジステアロイルホスファチジルコリン（DSPC）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（DOPE）、パルミトイルオレオイル-ホスファチジルコリン（POPC）、パルミトイルオレオイル-ホスファチジルエタノールアミン（POPE）、パルミトイルオレイオル-ホスファチジルグリセロール（POPG）、ジパルミトイル-ホスファチジルコリン（DPPC）、ジパルミトイル-ホスファチジルエタノールアミン（DPPE）、ジミリストイル-ホスファチジルエタノールアミン（DMPE）、ジステアロイル-ホスファチジルエタノールアミン（DSPE）、モノメチル-ホスファチジルエタノールアミン、ジメチル-ホスファチジルエタノールアミン、ジエライドイル-ホスファチジルエタノールアミン（DEPE）、ステアロイルオレオイル-ホスファチジルエタノールアミン（SOPE）、卵ホスファチジルコリン（EPC）、コレステロール、およびそれらの混合物からなる群より選択されるメンバーである。好ましい態様において、非カチオン性脂質は、DSPC、DPPC、またはDSPEである。]
    [0134] もう一つの態様において、核酸-脂質粒子は、粒子の凝集を阻害する複合脂質をさらに含む。ある種の例において、粒子の凝集を阻害する複合脂質は、ポリエチレングリコール（PEG）-脂質コンジュゲート、ポリアミド（ATTA）-脂質コンジュゲート、およびそれらの混合物からなる群より選択されるメンバーである。いくつかの態様において、PEG-脂質コンジュゲートは、PEG-ジアシルグリセロール、PEGジアルキルオキシプロピル、PEG-リン脂質、PEG-セラミド、およびそれらの混合物からなる群より選択されるメンバーである。好ましい態様において、粒子の凝集を阻害する複合脂質は、PEG-ジアルキルオキシプロピル（PEG-DAA）コンジュゲートを含む。ある種の例において、PEG-DAAコンジュゲートは、PEG-ジラウリルオキシプロピル（C12）コンジュゲート、PEG-ジミリスチルオキシプロピル（C14）コンジュゲート、PEG-ジパルミチルオキシプロピル（C16）コンジュゲート、およびPEG-ジステアリルオキシプロピル（C18）コンジュゲートからなる群より選択されるメンバーである。好ましい態様において、PEG-DAAコンジュゲートはPEG-ジミリスチルオキシプロピル（C14）コンジュゲートである。付加的なPEG-脂質コンジュゲートには、例えばPEG-C-DOMG、2KPEG-DMG、またはそれらの混合物が含まれる。]
    [0135] いくつかの態様において、カチオン性脂質は、粒子中に存在する全脂質の約20モル％〜約50モル％を構成する。好ましい態様において、カチオン性脂質は、粒子中に存在する全脂質の約40モル％を構成する。]
    [0136] 他の態様において、非カチオン性脂質は、粒子中に存在する全脂質の約5モル％〜約90モル％を構成する。ある種の例において、非カチオン性脂質は、粒子中に存在する全脂質の約10モル％を構成する。ある種の他の例において、非カチオン性脂質は、粒子中に存在する全脂質の約60モル％を構成する。]
    [0137] さらなる態様において、PEG-DAAコンジュゲートは、粒子中に存在する全脂質の0モル％〜約20モル％を構成する。好ましい態様において、PEG-DAAコンジュゲートは、粒子中に存在する全脂質の約2モル％を構成する。]
    [0138] 付加的な態様において、核酸-脂質粒子は、コレステロールをさらに含む。ある種の例において、コレステロールは、粒子中に存在する全脂質の約10モル％〜約60モル％を構成する。好ましい態様において、コレステロールは、粒子中に存在する全脂質の約48モル％を構成する。]
    [0139] もう一つの態様において、核酸-脂質粒子中の修飾siRNA分子は、20分間の37℃でのヌクレアーゼへの粒子の曝露の後、実質的に分解されない。関連する態様において、核酸-脂質粒子中の修飾siRNA分子は、30分間の37℃での血清中での粒子のインキュベーションの後、実質的に分解されない。好ましい態様において、修飾siRNAは、核酸-脂質粒子に完全に封入される。]
    [0140] ある種の例において、粒子は、約0.01〜約0.2のsiRNA:脂質重量比を有する。ある種の他の例において、粒子は、約0.02〜約0.1のsiRNA:脂質重量比を有する。さらに他の例において、粒子は、約0.08のsiRNA:脂質重量比を有する。]
    [0141] いくつかの例において、粒子は、約50nm〜約150mmの直径中央値を有する。他の例において、粒子は、約70nm〜約90mmの直径中央値を有する。]
    [0142] さらにもう一つの局面において、本発明は、
    （a）PLK-1発現をサイレンシングするsiRNA分子；
    （b）粒子中に存在する全脂質の約50モル％〜約85モル％を構成するカチオン性脂質；
    （c）粒子中に存在する全脂質の約13モル％〜約49.5モル％を構成する非カチオン性脂質；および
    （d）粒子中に存在する全脂質の約0.5モル％〜約2モル％を構成し、粒子の凝集を阻害する複合脂質
    を含む核酸-脂質粒子を提供する。]
    [0143] 一つの態様において、siRNA分子は、約15〜約60ヌクレオチド長の二本鎖領域を含む。もう一つの態様において、siRNA分子は、表1〜7および10〜11に示された配列のうちの少なくとも一つを含む。]
    [0144] ある種の態様において、カチオン性脂質は、DLinDMA、DLenDMA、DODAC、DDAB、DOTAP、DSDMA、DOTMA、DODMA、DC-Chol、DMRIE、DOSPA、DOGS、CLinDMA、CpLinDMA、DMOBA、DOcarbDAP、DLinDAP、DLincarbDAP、DLinCDAP、DLin-K-DMA、DLin-K-XTC2-DMA、およびそれらの混合物からなる群より選択されるメンバーである。好ましい態様において、カチオン性脂質はDLinDMAを含む。]
    [0145] もう一つの態様において、非カチオン性脂質はコレステロールまたはその誘導体を含む。ある種の例において、コレステロールまたはその誘導体は、粒子中に存在する全脂質の約30モル％〜約45モル％を構成する。一般に、コレステロール誘導体は、コレスタノール、コレスタノン、コレステノン、コプロスタノール、コレステリル-2'-ヒドロキシエチルエーテル、およびコレステリル-4'-ヒドロキシブチルエーテルからなる群より選択されるメンバーである。]
    [0146] 一つの代替的な態様において、非カチオン性脂質はリン脂質を含む。もう一つの別の態様において、非カチオン性脂質は、リン脂質とコレステロールまたはその誘導体との混合物を含む。そのような態様において、リン脂質は、DPPC、DSPC、DOPE、POPC、POPE、POPG、DPPE、DMPE、DSPE、DEPE、SOPE、EPC、モノメチル-ホスファチジルエタノールアミン、ジメチル-ホスファチジルエタノールアミン、およびそれらの混合物からなる群より選択されるメンバーであり得る。ある種の例において、リン脂質は、粒子中に存在する全脂質の約4モル％〜約10モル％を構成し、かつコレステロールは、粒子中に存在する全脂質の約30モル％〜約40モル％を構成する。好ましい態様において、リン脂質はDPPCを含む。]
    [0147] さらにもう一つの態様において、粒子の凝集を阻害する複合脂質は、ポリエチレングリコール（PEG）-脂質コンジュゲート、ポリアミド（ATTA）-脂質コンジュゲート、およびそれらの混合物からなる群より選択されるメンバーである。いくつかの態様において、PEG-脂質コンジュゲートは、PEG-ジアシルグリセロール、PEGジアルキルオキシプロピル、PEG-リン脂質、PEG-セラミド、およびそれらの混合物からなる群より選択されるメンバーである。好ましい態様において、粒子の凝集を阻害する複合脂質は、PEG-ジアルキルオキシプロピル（PEG-DAA）コンジュゲートを含む。ある種の例において、PEG-DAAコンジュゲートは、PEG-ジラウリルオキシプロピル（C12）コンジュゲート、PEG-ジミリスチルオキシプロピル（C14）コンジュゲート、PEG-ジパルミチルオキシプロピル（C16）コンジュゲート、およびPEG-ジステアリルオキシプロピル（C18）コンジュゲートからなる群より選択されるメンバーである。一つの好ましい態様において、PEG-DAAコンジュゲートはPEG-ジミリスチルオキシプロピル（C14）コンジュゲートである。もう一つの好ましい態様において、PEG-DAAコンジュゲートはPEG-ジステアリルオキシプロピル（C18）コンジュゲートである。付加的なPEG-脂質コンジュゲートには、例えば、PEG-C-DOMG、2KPEG-DMG、またはそれらの混合物が含まれる。]
    [0148] さらなる態様において、核酸-脂質粒子中の核酸は、20分間の37℃でのヌクレアーゼへの粒子の曝露の後、実質的に分解されない。関連する態様において、核酸-脂質粒子中の核酸は、30分間の37℃での血清中での粒子のインキュベーションの後、実質的に分解されない。好ましい態様において、核酸は、核酸-脂質粒子に完全に封入される。]
    [0149] ある種の態様において、粒子は、約1〜約100の脂質:siRNA重量比を有する。ある種の他の態様において、粒子は、約5〜約15の脂質:siRNA重量比を有する。好ましくは、粒子は、約6の脂質:siRNA重量比を有する。いくつかの例において、粒子は、約50nm〜約150mmの直径中央値を有する。他の例において、粒子は、約70nm〜約90mmの直径中央値を有する。]
    [0150] 一つの好ましい態様において、本発明は、
    （a）PLK-1発現をサイレンシングするsiRNA分子；
    （b）粒子中に存在する全脂質の約56.5モル％〜約66.5モル％を構成するカチオン性脂質；
    （c）粒子中に存在する全脂質の約31.5モル％〜約42.5モル％を構成する非カチオン性脂質；および
    （d）粒子中に存在する全脂質の約1モル％〜約2モル％を構成し、粒子の凝集を阻害する複合脂質
    を含む核酸-脂質粒子を提供する。]
    [0151] 一つの態様において、siRNA分子は、約15〜約60ヌクレオチド長の二本鎖領域を含む。もう一つの態様において、siRNA分子は、表1〜7および10〜11に示された配列のうちの少なくとも一つを含む。]
    [0152] ある種の態様において、カチオン性脂質は、DLinDMA、DLenDMA、DODAC、DDAB、DOTAP、DSDMA、DOTMA、DODMA、DC-Chol、DMRIE、DOSPA、DOGS、CLinDMA、CpLinDMA、DMOBA、DOcarbDAP、DLinDAP、DLincarbDAP、DLinCDAP、DLin-K-DMA、DLin-K-XTC2-DMA、およびそれらの混合物からなる群より選択されるメンバーである。好ましくは、カチオン性脂質はDLinDMAを含む。]
    [0153] 他の態様において、非カチオン性脂質はコレステロールまたはその誘導体を含む。好ましくは、非カチオン性脂質はコレステロールを含む。]
    [0154] さらなる態様において、粒子の凝集を阻害する複合脂質は、PEG-ジアシルグリセロール、PEGジアルキルオキシプロピル、PEG-リン脂質、PEG-セラミド、およびそれらの混合物からなる群より選択されるPEG-脂質コンジュゲートである。好ましくは、粒子の凝集を阻害する複合脂質は、PEG-DAAコンジュゲートを含む。付加的なPEG-脂質コンジュゲートには、例えば、PEG-C-DOMG、2KPEG-DMG、またはそれらの混合物が含まれる。]
    [0155] もう一つの好ましい態様において、本発明は、
    （a）PLK-1発現をサイレンシングするsiRNA分子；
    （b）粒子中に存在する全脂質の約52モル％〜約62モル％を構成するカチオン性脂質；
    （c）粒子中に存在する全脂質の約36モル％〜約47モル％を構成する非カチオン性脂質；および
    （d）粒子中に存在する全脂質の約1モル％〜約2モル％を構成し、粒子の凝集を阻害する複合脂質
    を含む核酸-脂質粒子を提供する。]
    [0156] 一つの態様において、siRNA分子は、約15〜約60ヌクレオチド長の二本鎖領域を含む。もう一つの態様において、siRNA分子は、表1〜7および10〜11に示された配列のうちの少なくとも一つを含む。]
    [0157] ある種の態様において、カチオン性脂質は、DLinDMA、DLenDMA、DODAC、DDAB、DOTAP、DSDMA、DOTMA、DODMA、DC-Chol、DMRIE、DOSPA、DOGS、CLinDMA、CpLinDMA、DMOBA、DOcarbDAP、DLinDAP、DLincarbDAP、DLinCDAP、DLin-K-DMA、DLin-K-XTC2-DMA、およびそれらの混合物からなる群より選択されるメンバーである。好ましくは、カチオン性脂質はDLinDMAを含む。]
    [0158] ある種の他の態様において、非カチオン性脂質はリン脂質である。代替的な態様において、非カチオン性脂質はリン脂質とコレステロールまたはその誘導体との混合物を含む。リン脂質は、例えば、DPPC、DSPC、DOPE、POPC、POPE、POPG、DPPE、DMPE、DSPE、DEPE、SOPE、EPC、モノメチル-ホスファチジルエタノールアミン、ジメチル-ホスファチジルエタノールアミン、またはそれらの混合物であり得る。好ましくは、非カチオン性脂質はDPPCとコレステロールとの混合物を含む。そのような場合、DPPCは、典型的には、粒子中に存在する全脂質の約5モル％〜約9モル％を構成し、かつコレステロールは、典型的には、粒子中に存在する全脂質の約32モル％〜約37モル％を構成する。]
    [0159] さらなる態様において、粒子の凝集を阻害する複合脂質は、PEG-ジアシルグリセロール、PEGジアルキルオキシプロピル、PEG-リン脂質、PEG-セラミド、およびそれらの混合物からなる群より選択されるPEG-脂質コンジュゲートである。好ましくは、粒子の凝集を阻害する複合脂質には、PEG-DAAコンジュゲートが含まれる。付加的なPEG-脂質コンジュゲートには、例えば、PEG-C-DOMG、2KPEG-DMG、またはそれらの混合物が含まれる。]
    [0160] さらなる局面において、本発明は、本明細書に記載された核酸-脂質粒子と薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物を提供する。]
    [0161] もう一つの局面において、本発明は、本明細書に記載された核酸-脂質粒子と細胞を接触させることを含む、PLK-1発現をサイレンシングするsiRNAを細胞へ導入する方法を提供する。]
    [0162] 一つの態様において、細胞は哺乳動物体内にある。好ましくは、哺乳動物はヒトである。]
    [0163] さらにもう一つの局面において、本発明は、本明細書に記載された核酸-脂質粒子を哺乳動物対象へ投与することを含む、核酸のインビボ送達の方法を提供する。]
    [0164] いくつかの態様において、投与は、経口、鼻腔内、静脈内、腹腔内、筋肉内、関節内、病巣内、気管内、皮下、および皮内からなる群より選択される。好ましい態様において、哺乳動物対象はヒトである。]
    [0165] さらなる局面において、本発明は、治療的に有効な量の本明細書に記載された核酸-脂質粒子を哺乳動物対象へ投与することを含む、その必要のある哺乳動物対象において癌を処置する方法を提供する。]
    [0166] ある種の態様において、癌は肝臓癌（例えば、肝細胞癌）である。好ましい態様において、哺乳動物対象はヒトである。]
    [0167] もう一つの局面において、本発明は、本明細書に記載された修飾siRNA分子と細胞を接触させることを含む、PLK-1発現をサイレンシングするsiRNAを細胞へ導入する方法を提供する。]
    [0168] 一つの態様において、修飾siRNA分子は、担体系の中にある。担体系は、例えば、核酸-脂質粒子、リポソーム、ミセル、ビロソーム、核酸複合体、またはそれらの混合物であり得る。典型的には、核酸複合体は、カチオン性脂質、カチオン性ポリマー、シクロデキストリン、またはそれらの混合物と複合体化された修飾siRNA分子を含む。ある種の例において、修飾siRNA分子は、ポリエチレンイミン（PEI）であるカチオン性ポリマーと複合体化される。好ましい態様において、担体系は、修飾siRNA分子と、カチオン性脂質と、非カチオン性脂質とを含む核酸-脂質粒子である。]
    [0169] ある種の態様において、核酸-脂質粒子は、粒子の凝集を防止する複合脂質をさらに含む。他の態様において、核酸-脂質粒子の存在は、粒子の投与の少なくとも1時間後に検出可能である。さらに他の態様において、多数の粒子のうちの10％超が、投与の約1時間後に哺乳動物の血漿中に存在する。さらなる態様において、細胞は哺乳動物体内にある。好ましくは、哺乳動物はヒトである。]
    [0170] さらにもう一つの局面において、本発明は、本明細書に記載された修飾siRNA分子を哺乳動物対象へ投与することを含む、PLK-1発現をサイレンシングするsiRNAのインビボ送達の方法を提供する。]
    [0171] 一つの態様において、修飾siRNA分子は、担体系の中にある。担体系は、例えば、核酸-脂質粒子、リポソーム、ミセル、ビロソーム、核酸複合体、またはそれらの混合物であり得る。典型的には、核酸複合体は、カチオン性脂質、カチオン性ポリマー、シクロデキストリン、またはそれらの混合物と複合体化された修飾siRNA分子を含む。ある種の例において、修飾siRNA分子は、ポリエチレンイミン（PEI）であるカチオン性ポリマーと複合体化される。好ましい態様において、担体系は、修飾siRNA分子と、カチオン性脂質と、非カチオン性脂質とを含む核酸-脂質粒子である。]
    [0172] ある種の態様において、核酸-脂質粒子は、粒子の凝集を防止する複合脂質をさらに含む。他の態様において、投与は、経口、鼻腔内、静脈内、腹腔内、筋肉内、関節内、病巣内、気管内、皮下、および皮内からなる群より選択される。好ましい態様において、哺乳動物対象はヒトである。]
    [0173] さらにもう一つの局面において、本発明は、治療的に有効な量の本明細書に記載された修飾siRNA分子を哺乳動物対象へ投与することを含む、その必要のある哺乳動物対象において癌を処置する方法を提供する。]
    [0174] ある種の態様において、癌は、肝臓癌（例えば、肝細胞癌）である。好ましい態様において、哺乳動物対象はヒトである。]
    [0175] さらなる局面において、本発明は、
    （a）免疫刺激特性を有し、かつ約15〜約60ヌクレオチド長の二本鎖領域を含む、PLK-1発現をサイレンシングすることができる未修飾siRNA配列を準備する段階；および
    （b）1個または複数個のヌクレオチドを修飾ヌクレオチドに置換することにより、未修飾siRNA配列を修飾し、それにより、未修飾siRNA配列より低免疫刺激性であり、かつPLK-1発現をサイレンシングすることができる修飾siRNA分子を作製する段階
    を含む、PLK-1発現をサイレンシングする免疫刺激性siRNAを修飾する方法を提供する。]
    [0176] 一つの態様において、修飾siRNA分子は、2'-O-メチル（2'OMe）ヌクレオチド、2'-デオキシ-2'-フルオロ（2'F）ヌクレオチド、2'-デオキシヌクレオチド、2'-O-(2-メトキシエチル)（MOE）ヌクレオチド、ロックド核酸（LNA）ヌクレオチド、およびそれらの混合物からなる群より選択される修飾ヌクレオチドを含む。好ましい態様において、修飾siRNA分子は2'OMeヌクレオチドを含む。非限定的な例として、2'OMeヌクレオチドは、2'OMe-グアノシンヌクレオチド、2'OMe-ウリジンヌクレオチド、およびそれらの混合物からなる群より選択され得る。]
    [0177] 典型的には、未修飾siRNA配列のヌクレオチドのうちの2個、3個、4個、5個、6個、7個、またはそれ以上が、修飾ヌクレオチドに置換されている。いくつかの態様において、未修飾siRNA配列の二本鎖領域のヌクレオチドのうちの約25％未満が、修飾ヌクレオチドに置換される。他の態様において、未修飾siRNA配列の二本鎖領域のヌクレオチドのうちの約20％未満が、修飾ヌクレオチドに置換される。さらに他の態様において、未修飾siRNA配列の二本鎖領域のヌクレオチドのうちの約15％未満が、修飾ヌクレオチドに置換される。付加的な態様において、未修飾siRNA配列の二本鎖領域のヌクレオチドのうちの約10％〜約20％が、修飾ヌクレオチドに置換される。]
    [0178] ある種の例において、修飾siRNA分子は、未修飾siRNA配列より少なくとも約70％低免疫刺激性である。ある種の他の例において、修飾siRNA分子は、未修飾siRNA配列のものの10倍以下であるIC50を有する。]
    [0179] いくつかの態様において、方法は、
    （c）修飾siRNA分子を哺乳動物応答細胞と、該応答細胞が検出可能な免疫応答を生ずるのに適した条件の下で接触させることにより、修飾siRNA分子が低免疫刺激性であることを確認する段階
    をさらに含む。]
    [0180] 関連する局面において、本発明は、
    （a）PLK-1発現をサイレンシングすることができる未修飾siRNA配列を、哺乳動物応答細胞と、該応答細胞が検出可能な免疫応答を生ずるのに適した条件の下で接触させる段階；
    （b）応答細胞における検出可能な免疫応答の存在により、未修飾siRNA配列を、免疫刺激性siRNAとして同定する段階；および
    （c）1個または複数個のヌクレオチドを修飾ヌクレオチドに置換することにより、未修飾siRNA配列を修飾し、それにより、未修飾siRNA配列より低免疫刺激性である修飾siRNA分子を作製する段階
    を含む、PLK-1発現をサイレンシングする免疫刺激性siRNAを同定しかつ修飾する方法を提供する。]
    权利要求:

    請求項1
    ポロ様キナーゼ1（PLK-1）発現をサイレンシングすることができる、約15〜約60ヌクレオチド長の二本鎖領域を含む修飾siRNA分子であって、二本鎖領域内のヌクレオチドのうちの1個または複数個が修飾ヌクレオチドを含む、修飾siRNA分子。
    請求項2
    2'-O-メチル（2'OMe）ヌクレオチド、2'-デオキシ-2'-フルオロ（2'F）ヌクレオチド、2'-デオキシヌクレオチド、2'-O-(2-メトキシエチル)（MOE）ヌクレオチド、ロックド核酸（LNA）ヌクレオチド、およびそれらの混合物からなる群より選択される修飾ヌクレオチドを含む、請求項1記載の修飾siRNA分子。
    請求項3
    2'OMeヌクレオチドを含む、請求項1記載の修飾siRNA分子。
    請求項4
    二本鎖領域内に1個または複数個の修飾ヌクレオチドを有するセンス鎖を含む、請求項1記載の修飾siRNA分子。
    請求項5
    二本鎖領域内に1個または複数個の修飾ヌクレオチドを有するアンチセンス鎖をさらに含む、請求項4記載の修飾siRNA分子。
    請求項6
    二本鎖領域内に1個または複数個の修飾ヌクレオチドを有するアンチセンス鎖を含む、請求項1記載の修飾siRNA分子。
    請求項7
    二本鎖領域内に1個または複数個の修飾ヌクレオチドを有するセンス鎖をさらに含む、請求項6記載の修飾siRNA分子。
    請求項8
    その一方の鎖または両方の鎖に3'突出を含む、請求項1記載の修飾siRNA分子。
    請求項9
    3'突出内のヌクレオチドのうちの1個または複数個が修飾ヌクレオチドを含む、請求項8記載の修飾siRNA分子。
    請求項10
    二本鎖領域内のヌクレオチドのうちの約25％未満が修飾ヌクレオチドを含む、請求項1記載の修飾siRNA分子。
    請求項11
    対応する未修飾siRNA配列より低免疫刺激性である、請求項1記載の修飾siRNA分子。
    請求項12
    SEQID NO:2の核酸配列を含むアンチセンス鎖を含む、請求項1記載の修飾siRNA分子。
    請求項13
    SEQID NO:1の核酸配列を含むセンス鎖を含む、請求項1記載の修飾siRNA分子。
    請求項14
    SEQID NO:4の核酸配列を含むアンチセンス鎖を含む、請求項1記載の修飾siRNA分子。
    請求項15
    SEQID NO:3の核酸配列を含むセンス鎖を含む、請求項1記載の修飾siRNA分子。
    請求項16
    SEQID NO:403の核酸配列からなるアンチセンス鎖を含む、請求項1記載の修飾siRNA分子。
    請求項17
    SEQID NO:400の核酸配列からなるセンス鎖を含む、請求項1記載の修飾siRNA分子。
    請求項18
    PLK1424 2/6、PLK1424 U4/GU、PLK1424 U4/G、PLK773 G/GU、PLK1425 3/5、およびそれらの混合物からなる群より選択される、請求項1記載の修飾siRNA分子。
    請求項19
    PLK1424 2/6である、請求項1記載の修飾siRNA分子。
    請求項20
    担体系をさらに含む、請求項1記載の修飾siRNA分子。
    請求項21
    担体系が、核酸-脂質粒子、リポソーム、ミセル、ビロソーム、核酸複合体、およびそれらの混合物からなる群より選択される、請求項20記載の修飾siRNA分子。
    請求項22
    担体系が、核酸-脂質粒子である、請求項21記載の修飾siRNA分子。
    請求項23
    請求項1記載の修飾siRNA分子と薬学的に許容される担体とを含む、薬学的組成物。
    請求項24
    請求項1記載の修飾siRNA分子、カチオン性脂質、および非カチオン性脂質を含む、核酸-脂質粒子。
    請求項25
    カチオン性脂質が、1,2-ジリノレイルオキシ-N,N-ジメチルアミノプロパン（DLinDMA）、1,2-ジリノレニルオキシ-N,N-ジメチルアミノプロパン（DLenDMA）、N,N-ジオレイル-N,N-ジメチルアンモニウムクロリド（DODAC）、N,N-ジステアリル-N,N-ジメチルアンモニウムブロミド（DDAB）、N-(1-(2,3-ジオレオイルオキシ)プロピル)-N,N,N-トリメチルアンモニウムクロリド（DOTAP）、ジステアリルジメチルアンモニウム（DSDMA）、N-(1-(2,3-ジオレイルオキシ)プロピル)-N,N,N-トリメチルアンモニウムクロリド（DOTMA）、N,N-ジメチル-2,3-ジオレイルオキシプロピルアミン（DODMA）、3-(N-(N',N'-ジメチルアミノエタン)-カルバモイル)コレステロール（DC-Chol）、N-(1,2-ジミリスチルオキシプロパ-3-イル)-N,N-ジメチル-N-ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（DMRIE）、2,3-ジオレイルオキシ-N-[2(スペルミン-カルボキサミド)エチル]-N,N-ジメチル-1-プロパンアミニウムトリフルオロアセテート（DOSPA）、ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン(DOGS）、3-ジメチルアミノ-2-(コレスタ-5-エン-3-ベータ-オキシブタン-4-オキシ)-1-(cis,cis-9,12-オクタデカジエンオキシ)プロパン（CLinDMA）、2-[5'-(コレスタ-5-エン-3-ベータ-オキシ)-3'-オキサペントキシ)-3-ジメチル-1-(cis,cis-9',1-2'-オクタデカジエンオキシ)プロパン（CpLinDMA）、N,N-ジメチル-3,4-ジオレイルオキシベンジルアミン（DMOBA）、1,2-N,N'-ジオレイルカルバミル-3-ジメチルアミノプロパン（DOcarbDAP）、2,3-ジリノレオイルオキシ-N,N-ジメチルプロピルアミン（DLinDAP）、1,2-N,N'-ジリノレイルカルバミル-3-ジメチルアミノプロパン（DLincarbDAP）、1,2-ジリノレオイルカルバミル-3-ジメチルアミノプロパン（DLinCDAP）、およびそれらの混合物からなる群より選択されるメンバーである、請求項24記載の核酸-脂質粒子。
    請求項26
    カチオン性脂質がDLinDMAである、請求項24記載の核酸-脂質粒子。
    請求項27
    非カチオン性脂質が、ジステアロイルホスファチジルコリン（DSPC）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（DOPE）、パルミトイルオレオイル-ホスファチジルコリン（POPC）、パルミトイルオレオイル-ホスファチジルエタノールアミン（POPE）、パルミトイルオレイオル-ホスファチジルグリセロール（POPG）、ジパルミトイル-ホスファチジルコリン（DPPC）、ジパルミトイル-ホスファチジルエタノールアミン（DPPE）、ジミリストイル-ホスファチジルエタノールアミン（DMPE）、ジステアロイル-ホスファチジルエタノールアミン（DSPE）、モノメチル-ホスファチジルエタノールアミン、ジメチル-ホスファチジルエタノールアミン、ジエライドイル-ホスファチジルエタノールアミン（DEPE）、ステアロイルオレオイル-ホスファチジルエタノールアミン（SOPE）、卵ホスファチジルコリン（EPC）、コレステロール、およびそれらの混合物からなる群より選択されるメンバーである、請求項24記載の核酸-脂質粒子。
    請求項28
    非カチオン性脂質が、DSPC、DPPC、またはDSPEである、請求項24記載の核酸-脂質粒子。
    請求項29
    粒子の凝集を阻害する複合脂質をさらに含む、請求項24記載の核酸-脂質粒子。
    請求項30
    粒子の凝集を阻害する複合脂質が、ポリエチレングリコール（PEG）-脂質コンジュゲート、ポリアミド（ATTA）-脂質コンジュゲート、およびそれらの混合物からなる群より選択されるメンバーである、請求項29記載の核酸-脂質粒子。
    請求項31
    PEG-脂質コンジュゲートが、PEG-ジアシルグリセロール、PEGジアルキルオキシプロピル、PEG-リン脂質、PEG-セラミド、およびそれらの混合物からなる群より選択されるメンバーである、請求項30記載の核酸-脂質粒子。
    請求項32
    粒子の凝集を阻害する複合脂質が、ポリエチレングリコール（PEG）-ジアルキルオキシプロピル（PEG-DAA）コンジュゲートを含む、請求項30記載の核酸-脂質粒子。
    請求項33
    カチオン性脂質が、粒子中に存在する全脂質の約20モル％〜約50モル％を構成する、請求項24記載の核酸-脂質粒子。
    請求項34
    カチオン性脂質が、粒子中に存在する全脂質の約40モル％を構成する、請求項24記載の核酸-脂質粒子。
    請求項35
    非カチオン性脂質が、粒子中に存在する全脂質の約5モル％〜約90モル％を構成する、請求項24記載の核酸-脂質粒子。
    請求項36
    非カチオン性脂質が、粒子中に存在する全脂質の約10モル％を構成する、請求項24記載の核酸-脂質粒子。
    請求項37
    非カチオン性脂質が、粒子中に存在する全脂質の約60モル％を構成する、請求項24記載の核酸-脂質粒子。
    請求項38
    PEG-DAAコンジュゲートが、粒子中に存在する全脂質の0モル％〜約20モル％を構成する、請求項32記載の核酸-脂質粒子。
    請求項39
    PEG-DAAコンジュゲートが、粒子中に存在する全脂質の約2モル％を構成する、請求項32記載の核酸-脂質粒子。
    請求項40
    コレステロールをさらに含む、請求項24記載の核酸-脂質粒子。
    請求項41
    コレステロールが、粒子中に存在する全脂質の約10モル％〜約60モル％を構成する、請求項40記載の核酸-脂質粒子。
    請求項42
    コレステロールが、粒子中に存在する全脂質の約48モル％を構成する、請求項40記載の核酸-脂質粒子。
    請求項43
    修飾siRNA分子が核酸-脂質粒子に完全に封入されている、請求項24記載の核酸-脂質粒子。
    請求項44
    請求項24記載の核酸-脂質粒子と薬学的に許容される担体とを含む、薬学的組成物。
    請求項45
    （a）ポロ様キナーゼ1（PLK-1）発現をサイレンシングするsiRNA分子、（b）粒子中に存在する全脂質の約50モル％〜約85モル％を構成するカチオン性脂質、（c）粒子中に存在する全脂質の約13モル％〜約49.5モル％を構成する非カチオン性脂質、および（d）粒子中に存在する全脂質の約0.5モル％〜約2モル％を構成し、粒子の凝集を阻害する複合脂質を含む、核酸-脂質粒子。
    請求項46
    siRNA分子が、表1〜7および10〜11に示された配列のうちの少なくとも一つを含む、請求項45記載の核酸-脂質粒子。
    請求項47
    カチオン性脂質が、1,2-ジリノレイルオキシ-N,N-ジメチルアミノプロパン（DLinDMA）、1,2-ジリノレニルオキシ-N,N-ジメチルアミノプロパン（DLenDMA）、N,N-ジオレイル-N,N-ジメチルアンモニウムクロリド（DODAC）、N,N-ジステアリル-N,N-ジメチルアンモニウムブロミド（DDAB）、N-(1-(2,3-ジオレイルオキシ)プロピル)-N,N,N-トリメチルアンモニウムクロリド（DOTAP）、ジステアリルジメチルアンモニウム（DSDMA）、N-(1-(2,3-ジオレイルオキシ)プロピル)-N,N,N-トリメチルアンモニウムクロリド（DOTMA）、N,N-ジメチル-2,3-ジオレイルオキシプロピルアミン（DODMA）、3-(N-(N',N'-ジメチルアミノエタン)-カルバモイル)コレステロール（DC-Chol）、N-(1,2-ジミリスチルオキシプロパ-3-イル)-N,N-ジメチル-N-ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（DMRIE）、2,3-ジオレイルオキシ-N-[2(スペルミン-カルボキサミド)エチル]-N,N-ジメチル-1-プロパンアミニウムトリフルオロアセテート（DOSPA）、ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン(DOGS）、3-ジメチルアミノ-2-(コレスタ-5-エン-3-ベータ-オキシブタン-4-オキシ)-1-(cis,cis-9,12-オクタデカジエンオキシ)プロパン（CLinDMA）、2-[5'-(コレスタ-5-エン-3-ベータ-オキシ)-3'-オキサペントキシ)-3-ジメチル-1-(cis,cis-9',1-2'-オクタデカジエンオキシ)プロパン（CpLinDMA）、N,N-ジメチル-3,4-ジオレイルオキシベンジルアミン（DMOBA）、1,2-N,N'-ジオレイルカルバミル-3-ジメチルアミノプロパン（DOcarbDAP）、2,3-ジリノレオイルオキシ-N,N-ジメチルプロピルアミン（DLinDAP）、1,2-N,N'-ジリノレイルカルバミル-3-ジメチルアミノプロパン（DLincarbDAP）、1,2-ジリノレオイルカルバミル-3-ジメチルアミノプロパン（DLinCDAP）、およびそれらの混合物からなる群より選択されるメンバーである、請求項45記載の核酸-脂質粒子。
    請求項48
    カチオン性脂質がDLinDMAを含む、請求項47記載の核酸-脂質粒子。
    請求項49
    非カチオン性脂質がコレステロールまたはその誘導体を含む、請求項45記載の核酸-脂質粒子。
    請求項50
    コレステロールまたはその誘導体が、粒子中に存在する全脂質の約30モル％〜約45モル％を構成する、請求項49記載の核酸-脂質粒子。
    請求項51
    コレステロール誘導体が、コレスタノール、コレスタノン、コレステノン、コプロスタノール、コレステリル-2'-ヒドロキシエチルエーテル、およびコレステリル-4'-ヒドロキシブチルエーテルからなる群より選択されるメンバーである、請求項49記載の核酸-脂質粒子。
    請求項52
    非カチオン性脂質がリン脂質を含む、請求項45記載の核酸-脂質粒子。
    請求項53
    非カチオン性脂質がリン脂質とコレステロールまたはその誘導体との混合物を含む、請求項45記載の核酸-脂質粒子。
    請求項54
    リン脂質が、ジパルミトイルホスファチジルコリン（DPPC）、ジステアロイルホスファチジルコリン（DSPC）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（DOPE）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（POPC）、パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン（POPE）、パルミトイルオレイオルホスファチジルグリセロール（POPG）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（DPPE）、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン（DMPE）、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（DSPE）、モノメチルホスファチジルエタノールアミン、ジメチルホスファチジルエタノールアミン、ジエライドイルホスファチジルエタノールアミン（DEPE）、ステアロイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン（SOPE）、卵ホスファチジルコリン（EPC）、およびそれらの混合物からなる群より選択されるメンバーである、請求項52または53記載の核酸-脂質粒子。
    請求項55
    リン脂質が、粒子中に存在する全脂質の約4モル％〜約10モル％を構成し、かつコレステロールが、粒子中に存在する全脂質の約30モル％〜約40モル％を構成する、請求項53記載の核酸-脂質粒子。
    請求項56
    コレステロール誘導体が、コレスタノール、コレスタノン、コレステノン、コプロスタノール、コレステリル-2'-ヒドロキシエチルエーテル、およびコレステリル-4'-ヒドロキシブチルエーテルからなる群より選択されるメンバーである、請求項53記載の核酸-脂質粒子。
    請求項57
    リン脂質がDPPCを含む、請求項54記載の核酸-脂質粒子。
    請求項58
    粒子の凝集を阻害する複合脂質が、ポリエチレングリコール（PEG）-脂質コンジュゲート、ポリアミド（ATTA）-脂質コンジュゲート、およびそれらの混合物からなる群より選択されるメンバーである、請求項45記載の核酸-脂質粒子。
    請求項59
    PEG-脂質コンジュゲートが、PEG-ジアシルグリセロール、PEGジアルキルオキシプロピル、PEG-リン脂質、PEG-セラミド、PEG-コレステロール、およびそれらの混合物からなる群より選択されるメンバーである、請求項58記載の核酸-脂質粒子。
    請求項60
    粒子の凝集を阻害する複合脂質が、ポリエチレングリコール（PEG）-ジアルキルオキシプロピル（PEG-DAA）コンジュゲートを含む、請求項58記載の核酸-脂質粒子。
    請求項61
    siRNA分子が核酸-脂質粒子に封入されている、請求項45記載の核酸-脂質粒子。
    請求項62
    （a）ポロ様キナーゼ1（PLK-1）発現をサイレンシングするsiRNA分子、（b）粒子中に存在する全脂質の約56.5モル％〜約66.5モル％を構成するカチオン性脂質、（c）粒子中に存在する全脂質の約31.5モル％〜約42.5モル％を構成する非カチオン性脂質、および（d）粒子中に存在する全脂質の約1モル％〜約2モル％を構成し、粒子の凝集を阻害する複合脂質を含む、核酸-脂質粒子。
    請求項63
    siRNA分子が、表1〜7および10〜11に示された配列のうちの少なくとも一つを含む、請求項62記載の核酸-脂質粒子。
    請求項64
    カチオン性脂質がDLinDMAを含む、請求項62記載の核酸-脂質粒子。
    請求項65
    非カチオン性脂質がコレステロールを含む、請求項62記載の核酸-脂質粒子。
    請求項66
    粒子の凝集を阻害する複合脂質がPEG-DAAコンジュゲートを含む、請求項62記載の核酸-脂質粒子。
    請求項67
    （a）ポロ様キナーゼ1（PLK-1）発現をサイレンシングするsiRNA分子、（b）粒子中に存在する全脂質の約52モル％〜約62モル％を構成するカチオン性脂質、（c）粒子中に存在する全脂質の約36モル％〜約47モル％を構成する非カチオン性脂質、および（d）粒子中に存在する全脂質の約1モル％〜約2モル％を構成し、粒子の凝集を阻害する複合脂質を含む、核酸-脂質粒子。
    請求項68
    siRNA分子が、表1〜7および10〜11に示された配列のうちの少なくとも一つを含む、請求項67記載の核酸-脂質粒子。
    請求項69
    カチオン性脂質がDLinDMAを含む、請求項67記載の核酸-脂質粒子。
    請求項70
    非カチオン性脂質がDPPCとコレステロールとの混合物を含む、請求項67記載の核酸-脂質粒子。
    請求項71
    DPPCが、粒子中に存在する全脂質の約5モル％〜約9モル％を構成し、かつコレステロールが、粒子中に存在する全脂質の約32モル％〜約37モル％を構成する、請求項70記載の核酸-脂質粒子。
    請求項72
    粒子の凝集を阻害する複合脂質がPEG-DAAコンジュゲートを含む、請求項67記載の核酸-脂質粒子。
    請求項73
    請求項45、62、または67のいずれか一項記載の核酸-脂質粒子と薬学的に許容される担体とを含む、薬学的組成物。
    請求項74
    細胞を請求項45、62、または67のいずれか一項記載の核酸-脂質粒子と接触させる工程を含む、ポロ様キナーゼ1（PLK-1）発現をサイレンシングするsiRNAを細胞へ導入するための方法。
    請求項75
    細胞が哺乳動物体内にある、請求項74記載の方法。
    請求項76
    請求項45、62、または67のいずれか一項記載の核酸-脂質粒子を哺乳動物対象へ投与する工程を含む、ポロ様キナーゼ1（PLK-1）発現をサイレンシングするsiRNAのインビボ送達のための方法。
    請求項77
    投与が、経口、鼻腔内、静脈内、腹腔内、筋肉内、関節内、病巣内、気管内、皮下、および皮内からなる群より選択される、請求項76記載の方法。
    請求項78
    治療的に有効な量の請求項45、62、または67のいずれか一項記載の核酸-脂質粒子を哺乳動物対象へ投与する工程を含む、その必要のある哺乳動物対象において癌を処置するための方法。
    請求項79
    癌が肝臓癌である、請求項78記載の方法。
    請求項80
    肝臓癌が肝細胞癌である、請求項79記載の方法。
    請求項81
    細胞を請求項1記載の修飾siRNA分子と接触させる工程を含む、ポロ様キナーゼ1（PLK-1）発現をサイレンシングするsiRNAを細胞へ導入するための方法。
    請求項82
    修飾siRNAが担体系の中にある、請求項81記載の方法。
    請求項83
    担体系が、核酸-脂質粒子、リポソーム、ミセル、ビロソーム、核酸複合体、およびそれらの混合物からなる群より選択される、請求項82記載の方法。
    請求項84
    担体系が、修飾siRNA分子、カチオン性脂質、および非カチオン性脂質を含む核酸-脂質粒子である、請求項82記載の方法。
    請求項85
    核酸-脂質粒子が、粒子の凝集を防止する複合脂質をさらに含む、請求項84記載の方法。
    請求項86
    細胞が哺乳動物体内にある、請求項81記載の方法。
    請求項87
    請求項1記載の修飾siRNA分子を哺乳動物対象へ投与する工程を含む、ポロ様キナーゼ1（PLK-1）発現をサイレンシングするsiRNAのインビボ送達のための方法。
    請求項88
    修飾siRNAが担体系の中にある、請求項87記載の方法。
    請求項89
    担体系が、核酸-脂質粒子、リポソーム、ミセル、ビロソーム、核酸複合体、およびそれらの混合物からなる群より選択される、請求項88記載の方法。
    請求項90
    担体系が、修飾siRNA分子、カチオン性脂質、および非カチオン性脂質を含む核酸-脂質粒子である、請求項88記載の方法。
    請求項91
    核酸-脂質粒子が、粒子の凝集を防止する複合脂質をさらに含む、請求項90記載の方法。
    請求項92
    治療的に有効な量の請求項1記載の修飾siRNA分子を哺乳動物対象へ投与する工程を含む、その必要のある哺乳動物対象において癌を処置するための方法。
    請求項93
    癌が肝臓癌である、請求項92記載の方法。
    請求項94
    肝臓癌が肝細胞癌である、請求項93記載の方法。
    請求項95
    （a）免疫刺激特性を有しかつ約15〜約60ヌクレオチド長の二本鎖領域を含む、PLK-1発現をサイレンシングすることができる未修飾siRNA配列を準備する工程、および（b）1個または複数個のヌクレオチドを修飾ヌクレオチドに置換することにより、未修飾siRNA配列を修飾し、それにより、未修飾siRNA配列より低免疫刺激性でありかつPLK-1発現をサイレンシングすることができる修飾siRNA分子を作製する工程を含む、ポロ様キナーゼ1（PLK-1）発現をサイレンシングする免疫刺激性siRNAを修飾するための方法。
    請求項96
    修飾siRNA分子が、2'-O-メチル（2'OMe）ヌクレオチド、2'-デオキシ-2'-フルオロ（2'F）ヌクレオチド、2'-デオキシヌクレオチド、2'-O-(2-メトキシエチル)（MOE）ヌクレオチド、ロックド核酸（LNA）ヌクレオチド、およびそれらの混合物からなる群より選択される修飾ヌクレオチドを含む、請求項95記載の方法。
    請求項97
    修飾siRNA分子が2'OMeヌクレオチドを含む、請求項95記載の方法。
    請求項98
    未修飾siRNA配列の二本鎖領域内のヌクレオチドのうちの約25％未満が、修飾ヌクレオチドに置換される、請求項95記載の方法。
    請求項99
    （c）修飾siRNA分子を哺乳動物応答細胞と、該応答細胞が検出可能な免疫応答を生ずるのに適した条件の下で、接触させることにより、修飾siRNA分子が低免疫刺激性であることを確認する工程をさらに含む、請求項95記載の方法。
    請求項100
    （a）PLK-1発現をサイレンシングすることができる未修飾siRNA分子を、哺乳動物応答細胞と、該応答細胞が検出可能な免疫応答を生ずるのに適した条件の下で接触させる工程、（b）応答細胞における検出可能な免疫応答の存在により、未修飾siRNA配列を、免疫刺激性siRNAとして同定する工程、および（c）1個または複数個のヌクレオチドを修飾ヌクレオチドに置換することにより、未修飾siRNA配列を修飾し、それにより、未修飾siRNA配列より低免疫刺激性である修飾siRNA分子を作製する工程を含む、ポロ様キナーゼ1（PLK-1）発現をサイレンシングする免疫刺激性siRNAを同定しかつ修飾するための方法。
    請求項101
    修飾siRNA分子が、2'-O-メチル（2'OMe）ヌクレオチド、2'-デオキシ-2'-フルオロ（2'F）ヌクレオチド、2'-デオキシヌクレオチド、2'-O-(2-メトキシエチル)（MOE）ヌクレオチド、ロックド核酸（LNA）ヌクレオチド、およびそれらの混合物からなる群より選択される修飾ヌクレオチドを含む、請求項100記載の方法。
    請求項102
    修飾siRNA分子が2'OMeヌクレオチドを含む、請求項100記載の方法。
    請求項103
    未修飾siRNA配列の二本鎖領域内のヌクレオチドのうちの約25％未満が、修飾ヌクレオチドに置換される、請求項100記載の方法。
    請求項104
    哺乳動物応答細胞が末梢血単核細胞または樹状細胞である、請求項100記載の方法。
    請求項105
    検出可能な免疫応答が、TNF-α、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IL-6、IL-12、およびそれらの組み合わせからなる群より選択されるサイトカインまたは増殖因子の産生を含む、請求項100記載の方法。
    請求項106
    検出可能な免疫応答が、テトラトリコペプチドリピートを含むインターフェロンにより誘導されるタンパク質1（interferon-induced protein with tetratricopeptide repeats 1（IFIT1））の誘導を含む、請求項100記載の方法。
    請求項107
    化学療法薬を投与する前に、細胞を、ポロ様キナーゼ1（PLK-1）発現をサイレンシングするsiRNA分子と接触させる工程を含む、化学療法薬の効果に対して細胞を感作するための方法。
    請求項108
    細胞が、PLK-1発現をサイレンシングする修飾siRNA分子と接触させられる、請求項107記載の方法。
    請求項109
    前記siRNA分子が担体系の中にある、請求項107記載の方法。
    請求項110
    担体系が、前記siRNA分子、カチオン性脂質、および非カチオン性脂質を含む核酸-脂質粒子である、請求項109記載の方法。
    請求項111
    細胞が癌細胞である、請求項107記載の方法。
    請求項112
    癌細胞が哺乳動物体内にある、請求項111記載の方法。
    請求項113
    化学療法薬が、パクリタキセル、フルオロウラシル（5-FU）、イリノテカン、ソラフェニブ、およびそれらの混合物からなる群より選択される、請求項107記載の方法。
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